1、申報國家自然科學基金項目申請書樣板各位申請人： 院科教部從我院申報國家自然科學基金項目中挑選了一份嚴格按照報告正文撰寫提綱要求撰寫，并在撰寫的整體布局、寫作方法上比較適宜的申請書作為樣板申請書，提供給其他申請人在撰寫申請書時參考。注：考慮到本項目也將申請國家自然科學基金，從技術保密方面考慮，涉及核心技術和關鍵問題之處將以“XXXXXXX”代替。報告正文（一）立項依據與研究內容1立項依據肝纖維化是嚴重威脅人類健康的重要疾病之一，迄今沒有滿意的治療方法。目前國內外絕大多數學者認為，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纖維化的關鍵，抑制HSC的激活對肝纖維化的防治

2、有重要價值1。粉防己堿（tetrandrine，又名漢防己甲素）是中藥粉防己（Stephania tetrandra S Moore）的主要有效生物堿成分，具有廣泛的藥理作用。抗肝纖維化是Tet的重要應用領域之一。我們研究室在過去的十幾年中，對Tet抗肝纖維化作用及機制進行了系統研究，證實Tet是抗肝纖維化有效藥物。然而，由于Tet的劑量安全范圍較小，以往研究發現的抗肝纖維化有效劑量與中毒劑量比較接近，故成為限制其臨床應用的重要因素。近年國內Tet抗肝纖維化研究也由此逐漸走向低谷。為減少毒副反應，拓展該藥物的臨床應用，我們近四年從降低Tet的單藥劑量、聯合用藥及改造藥物毒性基團等方面進行實驗性

3、探索。新近，我們在國內外首次發現，低濃度Tet能上調轉化生長因子（transforming growth factor factor ，TGF-）抑制性信號分子Smad 7表達，調控TGF-Smad信號通路，抑制體外培養靜止期HSC活化，阻斷TGF-1促靜止期HSC活化效應，Tet還誘導活化HSC活化逆轉。部分最新研究成果已經整理成文發表在本領域有一定影響力的SCI索引源期刊上，并被SCI收錄(收錄號 IDS Number: 963XN )2（相關文章參詳見申請人簡歷及附件二、三）。這些全新研究成果進一步增強了我們開發這一傳統中藥的信心。TGF-1是目前認識的最重要的促肝纖維化因子。抑制TGF

4、-1對HSC的作用一直以來均是抗肝纖維化重要著眼點3。Smad 7是HSC TGF-信號通路的最主要負反饋調節信號分子，上調Smad 7是抑制TGF-對HSC不良生物效應的有措施之一4。在肝纖維化過程中，TGF-信號通路還與整合素信號通路存在密切聯系。這表現在三個方面：XXXXXX。XXXXXX。XXXXXXXXX。綜上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可進一步實現XXXXX治療。基于以上研究結果，我們研究室在國家自然科學基金資助下，過去三年中應用化學方法合成了RGD和M6P，并將RGD與M6P結合成一新型復合分子RGD-M6P，研究比較了它們對HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（項目名

5、稱：RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究，編號：30170412）。我們的研究發現，RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGF-激活同時，還可阻止HSC與ECM結合，阻斷整合素信號轉導。研究還發現，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部濃度，使RGD-M6P顯示出較RGD更強的抑制作用14。我們首次證實，新型復合分子RGD-M6P用于抗肝纖維化治療，無論在對HSC靶向的特異性，還是多位點聯合作用方面，都優于單一的含RGD序列的肽段或M6P（參見基金結題摘要，相關文章參見申請人簡歷及附件四）。RGD-M6P新型復合分子的研制成功及其對HSC靶向與抑制功

6、能的發現，有助于我們去研究更多的HSC靶向選擇性高、局部作用強、系統毒性小的新型藥物和(或)制劑，從而提高藥物的療效、減輕毒性反應。結合我們對Tet藥理作用的分子機制的研究結果，不難發現，XXXXXXXX。基于以上系列研究基礎與設想，緊跟國內外在制劑學方面的進展，我們擬設計XXXXXXXXXXX。當前，受體調節藥物靶向（receptor-mediated drug targeting）作為一種新型的給藥系統受到人們的重視16。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今為止，尚未見到XXXXXXXXXXX。結合國內外同行的研究報道與我們的研究基礎，不難推斷，XXXXXXXXXXXXXXXXX。綜上

7、所述，我們擬在XXXXXXXXXX。本研究將為XXXXXXXX等提供理論與實踐基礎。XXXXXXXXXX可以設想，如能取得預期效果，經過良好設計的基礎研究后，這一XXXXXX應用于臨床的時間不會太久，前景廣闊。參考文獻1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004;1(2):98-105.2 Chen YW, Li DG, Wu JX, et al. Tetran

8、drine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305.3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et al. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver disease. Alcohol Cl

9、in Exp Res 2005;29(11 Suppl):121S-131S.4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et al. Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91.5 Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et al. The integrin alphavbeta3 is a receptor for the latency-asso

10、ciated peptides of transforming growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003;369(Pt 2):311-8.6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol 2004;165(5):723-34.7 XXXXXXXXXXXXXXXXX.2 項目的研究內

11、容、研究目標，以及擬解決的關鍵問題2.1研究內容：2.2.1 XXXXX化學合成與鑒定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成與鑒定。 2.2.2 不同類型脂質體的制備、技術參數優化、物理性質鑒定和脂質體藥物包封率、載藥量、配體結合率鑒定與提高。2.2.3 大鼠HSC分離培養，XXXXXXX 修飾脂質體與肝星狀細胞體外結合活性研究。2.2.4 XXXXX 修飾XXXXXXXXX 對肝星狀細胞活化、增殖、XXXXXXX 信號通路影響。2.2.5 XXXXXXXXX 的藥代動力學特征、組織分布特征和XXXXXXX 研究。2.2.6 XXXXXXXX 對膽總管結扎和CCl4大鼠肝纖維化防治作用。

12、2.2研究目標：2.2.1 研究構建XXXXXXXX，為抗肝纖維化藥物新劑型開發提供新型靶向載體。2.2.2 研究XXXXXX 對HSC生物活性影響及機制，為中西藥結合肝纖維化雙靶向、多靶點、協同治療提供理論基礎。2.2.3 研究XXXXXXXX 體內HSC靶向性及防治實驗性肝纖維化的有效性，為開發中藥新劑型、提高藥物在靶組織濃度、降低有效劑量、減輕副作用和提高療效提供實踐基礎。2.3 擬解決的關鍵問題：2.3.1 高藥物包封率、高配體修飾率的穩定XXXXXXXX 制備。2.3.2 放射性計數法測定XXXXXX 與HSC結合活性，有效抑制HSC活化的劑量、時間參數等。2.3.3 XXXXXX

13、體內HSC靶向性、抗肝纖維化效果比較與評價。3 擬采取的研究方案及可行性分析3.1 研究方案：第一部分XXXXX 及XXXXX 合成(1) XXXXXX 合成及鑒定采用我們研究室建立的方法，化學合成XXXXXX。應用XXXXXXXXXX。合成反應圖示如下。高效液相（HPLC）、質譜等方法鑒定合成產物純度及分子量。反應圖（略）(2) XXXXXXXXXXX采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反應圖示如下。高效液相（HPLC）和質譜分析法進物產物純化與鑒定。反應圖（略）第二部分長循環脂質體制備、鑒定與技術條件優化 (1) 脂質體制備采用經我們改良的逆相蒸發法制備。具體方法如下：XXXXX

14、XXXXX。(2) 性質鑒定 XXXXXXXXXXXXXXXX。(3) 均勻設計優化處方 根據實驗結果及文獻，確定影響包封率的主要因素。以包封率為評價指標，采用二項逐步回歸計算回歸方程，并進行方差分析，優化條件。第三部分 XXXXX修飾長循環脂質體與HSC體外結合活性采用兩步膠原酶灌注和密度梯度離心法分離大鼠HSC，選擇靜止態和激活態的HSC，接種于6孔板上(細胞密度為5.0105/mL)。待貼壁后，1%胎牛血清DMEM培養過夜，細胞同步化。(1)配體結合的濃度-效應關系XXXXXXXXXXX。(2) 配體結合的時間-效應關系 XXXXXXXXXXXX。(3) 競爭抑制XXXXXXXXXX。(

15、4) 細胞熒光定位、配體表面結合率與內吞率測定XXXXXXXXXX。(5) 平衡解離常數(Kd )和細胞最大結合位點數(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX對HSC生物學特性影響與機制采用酶法分離大鼠HSC。新鮮分離的HSC，體外培養48 h后，作為靜止期HSC用于下游實驗，或培養1 w后消化傳代，繼續培養24 h后，作為活化的HSC用于下游實驗。(1) XXXXXXX對HSC活化狀態影響XXXXXXXXX。(2)XXXXXX對TGF-1效應影響XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGF-受體XXXXXXX 信號通路影響XXXXXXXXXXXXX

16、X。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1) XXXXXXXX 在肝纖維化大鼠體內的器官分布XXXXXXXXXX。(2) XXXXXXX 大鼠體內藥代動力學采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纖維化大鼠肝臟內分布采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纖維化(1)造模采用膽總管結扎和CCl4肝纖維化兩種動物模型。(2)分組及處理XXXXXXXXXXXXXX。(3)治療效果檢測主要比較以下指標：XXXXXXXXXXXXXXX。3.2技術路線技術路線圖（略）。3.3可行性分析3.3.1 立項依據有堅實的理論與實踐基礎。本研究是參閱大量文獻并結合

17、自身以往深厚的肝纖維化防治研究基礎，特別是結合近四年國家自然科學基金資助研究成果，在XXXX 化學合成及功能研究、低劑量XXX抗肝纖維化作用和機制的前期工作基礎上，提出的多途徑、互補協同與靶向治療肝纖維化的新探索。掌握了國內外在受體調節藥物靶向、低毒性高效中藥新劑型開發和以HSC的靶標的肝纖維化靶向治療中的最新研究動態，借鑒“雙靶向”干預的最新研究成果，并與自身實踐相結合，在理論上、實踐上均有可靠基礎。3.3.2 相關實驗技術成熟，實驗結果可信。本研究使用的實驗方法、動物模型和生物分子化學合成等多為國內外應用多年的經典方法，并有自身實踐基礎。本課題組由掌握以上技術的成員組成，相關技術已應用于科

18、研工作。3.3.3 人員配備合理，具有扎實的相關工作基礎和完善的實驗設備及技術支持。申請人長期從事肝纖維化防治研究，先后承擔包括國家自然基金在內的各類科研項目15項，指導或協助指導博士后、博士生及碩士生70余名。近四年主持了國家自然科學基金項目“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究(編號30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纖維化的實驗研究(編號30170411)”的研究工作，項目組主要成員參與并完成以上研究工作。實驗設計指導者、熟練技術人員及輔助人員等各司其職，可保障研究有條不紊的進行。新華醫院消化內科系上海交通大學醫學院（原上海第二醫科大學）國家級重點學科和“211”工程重

19、點建設學科的組成單位之一，長期從事肝纖維化防治研究，先后承擔包括國家自然科學基金在內的各級各類科研項目20余項。2005年7月，原上海第二醫科大學與原上海交通大學合并，組建新的上海交通大學。作為上海交通大學的附屬單位，將在科研究設備和技術上更方便的得到比以往更廣泛的支持。4 本項目的特色與創新之處4.1 本課題首次嘗試利用XXXXXXX構建HSC特異性受體調節藥物靶向載體。將新型配體人工化學合成、受體調節藥物靶向技術與新型脂質體載藥技術三者結合應用于肝纖維化防治，有很強的原始創新性。4.2 本課題首次研究XXXXX生物小分子通過XXXXX與中藥粉防己堿相聯合，多途徑、互補與協同防治肝纖維化。本

20、課題是利用分子機制指導中西藥聯合應用、構建中藥靶向制劑提高療效降低副作用和多途徑協同作用抗肝纖維化的全新嘗試，是在總結自身工作基礎上進行的大膽設想與創新。5 年度研究計劃及預期研究結果5.1 年度研究計劃：略2007.01-2007.052007.06-2008.122008.01-2008.052008.06-2009.102008.11-2009.032009.04-2009.105.2 預期研究成果5.2.1 獲得快速、有效和大量合成XXXXXXX和高藥物包封率、高配體修飾率的穩定XXXXXXXX的技參數，并合成足量研究相關產物。5.2.2 體外研究證實XXXXXXXX。5.2.3 在體

21、內XXXXXXXXX，有效降低有效劑量、提高療效和降低副作用。5.2.4 研究證實XXXXXXX可成為抗肝纖維化藥物新劑型開發的有效載體。（二）研究基礎與工作條件1 研究基礎1.1既往肝纖維化防治理論和技術。自1981年以來，我們研究室長期從事肝纖維化防治研究，先后對鈣拮抗劑、鈣調蛋白拮抗劑、大黃素、激活素、腎素-血管緊張素系統及卵泡抑素等在肝纖維化發生發展中的作用進行了系列的研究，積累了較豐富的理論，掌握了相關研究技術。承擔了包括國家自然科學基金在內的各類科研項目20多項，先后獲省部級以上科技進步獎10項。1.2粉防己堿抗肝纖維化研究工作積累。項目負責人率先在我國開展鈣拮抗劑尤其是中藥粉防己

22、堿對肝纖維化防治研究，取得豐富的粉防己堿抗肝纖維化基礎和臨床研究成果，在國內外期刊發表相關論文50余篇，獲省部級以上科技進步獎5項。近兩年，我們在上海市教委基金項目“粉防己堿影響肝星狀細胞活化信號分子研究（編號02BK14）”資助下完成了小劑量粉防己堿抗肝纖維化效果與機制的研究，在國內外首次報道小劑量粉防己堿可通過影響TGF-Smads信號通路抑制HSC活化，相關研究論文被SCI收錄(收錄號 IDS Number: 963XN)。該研究為指導粉防己堿在肝纖維化防治中應用有重要價值。（參見申請人簡歷及附件二、三）1.3生物小分子化學合成及脂質體構建相關工作基礎。近四年來，申請人承擔并完成了國家自

23、然科學基金項目“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究（編號 30170412）”，化學合成了RGD-M6P，分子克隆構建pCI-RGD-Smad7并成功通過脂質體進行基因轉染，通過體內外實驗觀察了RGD-M6P和pCI-RGD-Smad7的生物學效應。細胞及動物學實驗均證實pCI-RGD-Smad7和RGD-M6P可減輕ECM沉積，并影響TGF-1和整合素表達強度和分布。主要研究工作由本項目組成員參與并完成。目前我們正在利用基金很少量結余款項進行合成RGD-M6P修飾SSL的工作。得益于此，他（她）們分別熟練掌握了生物小分子的化學合成相關技術（多肽合成、固相化反應、納米技術、高效

24、分離技術等）、免疫組織與細胞化學技術、RT-PCR和定量PCR、蛋白印跡、高效液相分析、質譜分析、肝纖維化動物模型及生物信息學方法等與本課題相關的關鍵技術與方法（相關論文參見申請人簡歷）。由于以上的工作基礎，我們擁有豐富的生物分子合成經驗，成熟的生物分子構建技術和良好的人員與設備支持。已經構建成功的RGD-M6P及相關技術要領，可直接用于本課題。構思本課題的重要原因之一是探討解決簡單單一藥物治療中發現的諸多問題而開展的，密切相關的細胞學、動物學實驗基礎也是本實驗成功的重要保證。2 工作條件2.1 新華醫院消化內科設有校屬的上海交通大學醫學院消化系疾病第三研究室。實驗室擁有本項目研究相關的大部分

25、生化、細胞生物學及分子生物學等方面的各種儀器設備，如倒置顯微鏡攝影設備、計數儀、CO2培養箱、酶聯免疫測定儀、電轉膜儀、低溫冰箱、低溫超速離心機及其它分子生物學設備等。2.2 上海交通大學醫學院（原上海第二醫科大學）附屬新華醫院科研中心與設立在新華醫院的“211”工程重點建設單位上海市兒科醫學研究所為本項目開展提供了儀器、技術支持和信息服務平臺。我們可免費使用相關設備如層流無菌室、質譜儀、高效液相色譜儀、定量PCR儀、NICOMP Particle Sizer Model 3700分析系統、流式細胞儀和Flous-S MultiImage圖像分析儀等，新華醫院和學院均有SPF級的動物飼養條件。

26、3 申請人簡歷李定國，男，1946年9月出生。主任醫師、研究員、教授和博士生導師。1981年和1989年分別獲原上海第二醫科大學醫學碩士和醫學博士學位。現任上海交通大學醫學院消化系疾病第三研究室主任、上海交通大學醫學院附屬新華醫院消化內科主任。兼任上海市內科學會委員和上海市消化病學會委員等職。本項目負責人長期從事肝纖維化防治研究，在抗肝纖維化中藥篩選與機制研究、生物小分子合成、脂質體藥物傳遞和基因轉染、基因重組及基因治療等方面有豐富研究經驗。率先在我國開展鈣拮抗劑尤其是中藥粉防己堿對肝纖維化防治研究，取得豐富的粉防己堿抗肝纖維化基礎和臨床研究成果，在國內外期刊發表相關論文50余篇。先后承擔包括

27、國家自然基金在內的各類科研項目15項，指導或協助指導博士后、博士生及碩士生70余名，獲省部級以上科技進步獎10項。近四年主持了國家自然科學基金項目“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究(編號30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纖維化的實驗研究(編號30170411)”的肝纖維化防治研究工作（以上2項目均已經順利結題），指導完成上海市自然科學基金項目“Smad7和uPA雙基因共表達對實驗性肝纖維化的影響(編號03ZR14050)”和上海市教委基金項目“粉防己堿影響肝星狀細胞活化信號分子研究（編號02BK14）”。近五年發表的與本課題相關論文（第一作者或通訊作者），其中一篇與本課

28、題設計密切相關的重要論著2005年發表于SCI索引源期刊“Journal of Ethnopharmacology”并被SCI收錄（收錄號 IDS Number: 963XN）（見附件二、三）： 1 李定國, 陳穎偉。肝纖維化研究現狀及展望。上海第二醫科大學學報 2005；25(2):101-6。（述評）2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-bet

29、a in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005；100(3):299-305.（論著SCI收錄號 IDS Number: 963XN）3 Chen YW, Wu JX, Chen YW, Li DG, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(19):29

30、22-6. （論著）4 陳源文, 李定國, 吳建新, 陳穎偉, 陸漢明。粉防己堿對大鼠肝星狀細胞跨膜信號轉導的影響。中華肝臟病雜志 2005；13(8):609-10。（論著）5 陳源文, 李定國, 吳建新, 陳穎偉, 陸漢明。粉防己堿上調Smad7表達抑制大鼠肝星狀細胞活化。中國藥理學通報 2005；21(5):563-7。（論著）6 王志榮, 陳錫美, 李定國, 魏紅山, 黃新, 展玉濤, 汪余勤, 陸漢明。粉防己堿抑制肝纖維化大鼠肝組織c-fos和c-jun mRNA表達。上海醫學 2003；26(5):332-6。（論著）7 王志榮, 李定國, 陳錫美, 魏紅山, 黃新, 展玉濤, 徐

31、芹芳, 陸漢明。聯合應用粉防己堿與甘草酸抗肝纖維化的實驗研究。中華消化雜志 2003；23(7):435-6。（論著）8 王連升, 陳穎偉, 張建華, 李定國, 陸漢明。RGD-M6P對原代肝星狀細胞的影響。上海第二醫科大學學報 2005；25(2):112-5。（論著）9 杜學亮, 陳穎偉, 王連升, 徐芹芳, 李定國, 吳真。人工合成RGD小肽對肝星狀細胞付泌細胞外基質的影響。放射免疫學雜志 2004；17(6):433-5。（論著）10 程計林, 周欣, 高志剛, 霍玉青, 徐芹芳, 李定國。外源性轉化生長因子1與小鼠肝細胞Smad7 mRNA及蛋白表達的關系。中華醫學雜志 2002；8

32、2(2):111-3。（論著）11 陳源文, 吳建新, 李定國, 陸漢明。轉化生長因子-與轉基因治療肝纖維化。中華消化雜志 2002；22(10):621-3。（綜述）12 程計林, 周欣, 李定國, 魏紅山, 黃新, 王志榮, 展玉濤, 張晶, 徐芹芳, 陸漢明。RGDS肽對TGF刺激肝星狀細胞分泌細胞外基質的影響。臨床肝膽病雜志 2001；17(3):173-5。（論著）13 Wei FS, Li DG, Lu HM, Zhan YT, Wang ZR, Hang X, Xu QF. The role of enalapril in pathogenesis of CCL4 induced

33、 hepatic fibrosis. Journal of Shanghai Second Medical University 2001；13(1):19-23. （論著）14 程計林, 周欣, 李定國, 黃新, 魏紅山, 徐芹芳。精-甘-天冬-絲氨酸肽對肝纖維化鼠血清型膠原水平的影響。上海第二醫科大學學報 2001；21(3):210-2。（論著）15 陳穎偉, 李定國。 Smad7和組織器官纖維化。上海第二醫科大學學報 2005；25(2):132-3。（論著）16 陳穎偉, 陳源文, 王連升, 李定國。 Smad7基因過表達對L02肝細胞株增殖的影響。上海第二醫科大學學報 2005；2

34、5(2):103-6。（論著）17 陳穎偉, 陳源文, 尤漢寧, 李定國。 外源Smad7基因對原代肝星狀細胞活性和基因表達調控的影響。中華消化雜志 2005；25(7):409-12。（論著）18 汪余勤, 李定國, 吳建新, 宗春華, 董國芳, 瞿春瑩, 陸漢明。 血管緊張素對肝星狀細胞表達轉化生長因子、型受體及其功能的影響。中華消化雜志 2005；25(7):434-5。（論著）19 Zhou X, Li D, Li X, Lu H, Zhang W. A combination of Ang II and carbon tetrachloride accelerates process

35、 of hepatic fibrosis. Chin Med J 2003；116(1):62-5.（論著）20 陳穎偉, 衛新革, 展玉濤, 張文竹, 徐芹芳, 李定國。大黃與粉防己堿抗實驗性肝纖維化的對照研究。中華消化雜志 2003；23(8):476-9。（論著）在本課題中負責課題設計、組織實施、質量控制、數據收集整理和統計分析等。陳源文，男，1976年8月出生，博士。2000年畢業于江西醫學院臨床醫學系，獲學士學位，同年考入原上海第二醫科大學，2005年獲內科學博士學位。主要從事肝損傷機制及肝纖維化防治研究。在中藥（粉防己堿、氧化苦參堿）抗肝纖維化作用、細胞信號轉導、基因轉染與基因重組

36、和干細胞研究方面有較豐富的理論基礎與研究經歷。作為項目負責人完成校基金項目“氧化苦參堿對TGF-信號轉導的影響及機制（編號BXJ0215）”研究工作，負責完成上海市教委基金項目“粉防己堿影響肝星狀細胞活化信號分子研究（編號02BK14）”，并參與國家自然科學基金項目“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究(編號30170412）”的細胞學部分的研究工作。2005年申請國家自然科學基金項目“IL-10 或uPA 基因修飾骨髓源性肝干細胞移植防治肝纖維化的比較研究”獲資助（編號30500236）。近期發表的與本課題相關論文如下：1 陳源文, 吳建新, 李定國, 陸漢明。轉化生長因子-與

37、轉基因治療肝纖維化。中華消化雜志2002；22(10)：621-3。（綜述）2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005；100(3):299-305. （論著）3 Chen YW, Wu JX, Chen YW, Li DG,

38、 Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(19):2922-6. （論著）4 陳源文, 李定國，吳建新, 陳穎偉, 陸漢明。粉防己堿對大鼠肝星狀細胞跨膜信號轉導的影響。中華肝臟病雜志 2005；13(8):609-10。（論著）5 陳源文, 李定國, 吳建新, 陳穎偉, 陸漢明。粉防己堿上調Smad7表達抑制大鼠肝星狀細胞活化。

39、中國藥理學通報 2005；21(5):563-7。（論著）6陳穎偉, 陳源文, 王連升, 李定國。Smad7基因過表達對L02肝細胞株增殖的影響。上海第二醫科大學學報 2005；25(2):103-6。（論著）7 陳穎偉, 陳源文, 尤漢寧, 李定國。外源Smad7基因對原代肝星狀細胞活性和基因表達調控的影響。中華消化雜志 2005；25(7):409-412。（論著）在本課題中負責HSC分離培養及細胞學實驗（主要是配體修飾脂質體對HSC生物學特性影響等）研究工作。劉清華，女，1971年2月出生。副主任醫師，副教授。1996年和2003年分別獲上海第二醫科大學醫學碩士學位、醫學博士學位。主要研

40、究方向為肝損傷機制及肝纖維化防治。在肝纖維化性別差異細胞分子機制、生物小分子抗肝星狀細胞功能研究等領域有較豐富的研究經歷。作為課題負責人承擔院級基金項目“雌激素防治肝纖維化的實驗研究”，參與上海市教委基金項目“粉防己堿影響肝星狀細胞活化信號分子研究（編號02BK14）”以及國家自然科學基金項目“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究（編號30170412）”細胞學研究工作。近期發表與本課題相關的論文有：1 劉清華, 李定國, 黃新, 尤漢寧, 潘勤, 徐雷鳴, 徐芹芳, 陸漢明。激活素A對肝星狀細胞細胞外基質合成的影響。世界華人消化雜志 2003；11(6): 745-8。（論著）

41、2 劉清華, 李定國, 宗春華, 黃新, 徐芹芳, 陸漢明。17-雌二醇及代謝產物對大鼠HSC功能的影響。中華消化雜志 2004；24(5): 165-9。（論著）3 Qing-Hua Liu, Ding-Guo Li, Xin Huang, Chun-Hua Zong, Qin-Fang Xu, Han-Ming Lu. Suppressive effects of 17-estradiol on hepatic fibrosis in CCl4-induced rat model. World J Gastroenterol 2004; 10(9): 1315-20. （論著）4 劉清華,

42、 李定國, 宗春華, 黃新, 徐芹芳, 陸漢明。雌激素對雄性大鼠肝纖維化形成的影響。上海第二醫科大學學報 2005；25(1): 39-42。（論著）在本課題中參與細胞學實驗（主要是配體修飾脂質體對HSC生物學特性影響等）研究工作。蘭玲，女，1976年11月出生。碩士。2000年畢業于河南醫科大學臨床醫學系，獲醫學學士學位，2003年畢業于鄭州大學醫學院，獲醫學碩士學位，碩士期間主要從事食管癌高發區人群食管癌變機制和防治研究。現在上海第二醫科大學攻讀博士學位，從事干細胞研究工作。近期發表論文4篇。在本課題中參與受體調節載藥脂質體構建與細胞學功能分析。陳穎偉，女，1974年2月出生。博士，主治醫

43、師。1999年和2004分別獲原上海第二醫科大學獲醫學碩士和醫學博士學位。主要從事肝纖維化防治研究。在中藥（大黃素、粉防己堿）抗肝纖維化機制、HSC細胞信號轉導、生物小分子化學合成、純化與鑒定和重組腺病毒構建與基因轉染等方面有較豐富的理論與研究經驗積累。在攻讀碩士學位期間參與“大黃素抗肝纖維化作用研究”、“PDGF在肝纖維化發病機制中的作用研究”等課題研究。攻讀博士學位及工作期間參與上海市科學技術發展基金課題“肝星狀細胞信號傳導網絡新的調控分子”的研究工作，負責完成國家自然科學基金“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究(編號30170412)”的關鍵部分工作，作為項目負責人承擔上

44、海市自然科學基金項目“Smad7和uPA雙基因共表達對實驗性肝纖維化的影響(編號03ZR14050)”（該項目已經順利結題）。近期發表的與本課題相關論文：1陳穎偉, 衛新革, 展玉濤, 張文竹, 徐芹芳, 李定國。大黃與粉防已堿抗實驗性肝纖維化的對照研究。中華消化雜志 2003；23(8)：476-9。（論著）2陳穎偉, 展玉濤, 李定國。單味生大黃對肝纖維化的影響。中國中西醫結合雜志 2004；24(6)：110-3。（論著）3陳穎偉, 胡良凱, 陳源文, 李定國。新型Smad7重組腺病毒載體的構建。上海第二醫科大學學報 2004；24(6)：417-20。（論著）4陳穎偉, 陳源文, 尤漢

45、寧, 李定國。外源Smad7基因對原代肝星狀細胞活性和基因表達調控的影響。中華消化雜志 2005；25(7):409-12。（論著）5陳穎偉, 陳源文, 王連升, 李定國。Smad7基因過表達對L02肝細胞株增殖的影響。上海第二醫科大學學報 2005；25(2)：103-6。（論著）6王連升, 陳穎偉, 張建華, 李定國, 陸漢明。RGD-M6P對原代肝星狀細胞的影響。上海第二醫科大學學報 2005；25(2):112-5。（論著）7 杜學亮, 陳穎偉, 王連升, 徐芹芳, 李定國, 吳真。人工合成RGD小肽對肝星狀細胞付泌細胞外基質的影響。放射免疫學雜志 2004；17(6):433-5。（

46、論著）在本課題中主要負責RGD-M6P及相關分子合成、受體調節載藥脂質體的體外結合實驗。王連升，男，1976年8月出生。碩士。2001年畢業山東醫科大學，獲學士學位，同年考入原上海第二醫科大學，2004年獲碩士學位。主要從事抗肝纖維化生物小分子化學合成、純化鑒定和功能研究。在小肽合成分離與質譜分析、糖肽合成、純化、質譜與高效液相分析和載藥配體調節脂質體等方面有較豐富的理論基礎與研究經歷。主要參與了國家自然科學基金項目“RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究(編號30170412）”的RGD相關綴合分子化學合成與體內、體外功能研究部分工作。近期發表的與本課題相關論文： 1 王連升,

47、李定國。TGF及Smad與肝纖維化。國外醫學消化系疾病分冊，2003；23（4）：222-5。（綜述）2王連升, 陳穎偉, 張建華, 李定國, 陸漢明。RGD-M6P對原代肝星狀細胞的影響。上海第二醫科大學學報 2005；25(2):112-5。（論著）待發表論著：1 Wang LS, Chen YW, Li DG, Lu HM. RGD-M6P Inhibits the activation and proliferation of hepatic stellate cells in vitro. World J Gastroenterol 2006 (in press, Ms. NoWjg

48、/2005/002566) 在本課題中主要負責RGD-M6P及相關綴合分子合成、純化、質譜與高效液相分析，以及受體調節載藥脂質體構建和物理性質檢測。孫巧玲，女，1976年9月出生。碩士。2000年畢業于大連醫科大學臨床醫學系，獲學士學位，2003年畢業于大連醫科大學，獲醫學碩士學位，碩士期間主要從事基質金屬蛋白酶在食管癌中表達的研究。現在上海第二醫科大學攻讀博士學位。近期發表論文1篇。在本課題中負責動物實驗與分子生物學檢測實驗。丁小東，男，1977年7月出生，2000年畢業于白求恩醫科大學（現吉林大學白求恩醫學部）臨床醫療系，獲醫學學士學位。2003年畢業于復旦大學上海醫學院內科學專業，獲臨床

49、醫學碩士學位。一直從事慢性肝病，尤其是脂肪性肝病的研究工作，在肝損傷動物模型制作及藥物防治研究方面的較豐富的研究經歷。20002003年參加上海市科技啟明星計劃課題“微血栓在非酒精性脂肪性肝炎發病中作用”的研究，發表學術論文和專著17篇。近期發表的與本課題相關的論文有： 1丁曉東, 范建高, 王國良, 徐正婕, 鄭曉英, 田麗艷。二甲雙胍干預大鼠非酒精性脂肪性肝炎的療效觀察；肝臟2005；10;(3):79-81。2 丁曉東, 范建高, 徐正婕, 鄭曉英, 田麗艷, 王國良。高脂飲食性脂肪性肝炎大鼠肝臟線粒體損傷和ATP儲備改變。世界華人消化雜志2005；13(13):1524-8。3范建高、

50、丁曉東、王國良、徐正婕、鄭曉英、田麗艷。非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟UCP2表達及其與能量貯備的關系；中華肝臟病雜志2005；13(5):374-7。4范建高、丁曉東、王國良、徐正婕、鄭曉英、田麗艷。高脂飲食性非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟PPAR-表達增強。肝臟2004；9(4):225-8。在本課題中負責動物學實驗（藥代動力學、造模）與分子生物學檢測。張毅，男，1978年11月出生。碩士。2004年畢業于上海第二醫科大學，獲醫學碩士學位。現為上海第二醫科大學附屬新華醫院消化內科醫師，從事臨床與肝纖維化防治科研工作。發表論文1篇。在本課題中負責動物實驗及病理檢測。徐琴芳，女，1954年2月出生。主

51、管技師，為消化實驗室專職技術員，從事細胞、分子生物學實驗相關工作十余年。在本課題中負責生化、病理檢測。4 承擔科研項目情況目前在研項目名稱：IL-10 或uPA 基因修飾骨髓源性肝干細胞移植防治肝纖維化的比較研究，編號30500236，由國家自然科學基金委員會資助。計劃2006年1月起至2008年12月止，經費25.0萬元。項目組主要成員陳源文為項目負責人，陳穎偉、張毅等參與部分工作，包括uPA腺病毒感染骨髓源性肝干細胞效率、轉基因干細胞生物學特性變化的細胞學實驗和轉uPA基因干細胞移植的肝纖維化防治作用的部分動物學實驗等。本項目得益于一定的前期工作基礎和自申請初即開始相關研究，目前項目進展順

52、利，已經完成病毒構建、uPA腺病毒感染骨髓源性肝干細胞效率、實現外源基因在干細胞中表達，正在準備進行轉基因干細胞移植的動物學研究。5 完成自然科學基金項目情況國家自然科學基金項目：RGD修飾細胞生物信息調控分子和綴合基因的功能研究（編號30170412，起止年月：2002年1月-2004年12月）。項目已于2004年12月順利完成和結題。通過該項目研究工作，采用化學法合成了新型生物分子RGD-M6P，并研究了其抗肝纖維化功能。結果發現肝硬化時存在TGF-、整合素、Smad7信號分子分布和功能異常，RGD-M6P可影響TGF-和整合素表達強度和分布，減輕ECM沉積。動物實驗證實還RGD-M6P抗肝纖維化作用優于RGD、M6P或RGD與M6P簡單混合，提示RGD-M6P存在良好的靶向性。在此工作基礎上，進一步進行了干預TGF-Smad7信號通路抗肝纖維化的研究：成功構建攜外源Smad7基因腺病毒、Smad7與uPA共表達腺病毒，并進行了肝纖維化轉基因治療研究；研究了小劑量粉防己堿抗HSC活化與TGF-Smad7信號通路關系；目前嘗試開展利用RGD-M6P小分子實現HSC靶向和與其它藥物協同多