1、科目 細胞生物學實驗實驗題目 動物細胞融合日期2013.03.07姓名十 系年級 2011級生物基地 學號 土實驗一利用聚乙二醇為媒介物進行細胞融合摘要細胞融合(cell fusion)是在自發或人工誘導下，兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞?；具^程包括細胞融合形成異核體 (heterokaryon)、異核體通過細胞有絲分裂進行核融合、最終形成單核的雜種細 胞。誘導細胞融合的方法有三種：生物方法(病毒)、化學方法(聚乙二醇PEG、 物理方法(離心，震動，電刺激)。某些病毒如：仙臺病毒、副流感病毒和新城 雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白(fusion protein、，可介導病毒同宿

2、主細胞融合， 也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導細胞融合。 化學和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發生融合。關鍵詞細胞融合；人工誘導；PEG刖言人工誘導的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術而發展起來。由于它不 僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術目前被廣 泛應用于細胞生物學和醫學研究的各個領域。 基因型相同的細胞融合成的雜交細 胞稱為同核體(homokaryon );來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體(heterokaryon )。細胞融合不僅可用于基礎研究，而且

3、還有重要的應用價值，在植物育種方面 已經成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。細胞融合另 一個重要應用就是制備單克隆抗體， 單克隆抗體可以用作診斷試劑，治療疾病和 運載藥物，具有準確，高效，簡易，快速等優點。因此，融合細胞的研究為生物 學無論在基礎理論上或生產實踐上開辟了一條新的道路。這一技術已成為研究細 胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。一. 實驗目的1. 了解動物細胞融合的常用方法及原理。2. 掌握利用PEG為介導物對細胞進行誘導融合的方法。3. 觀察動物細胞融和過程中細胞的行為和變化。二. 實驗原理化學融合劑聚乙二醇（polyethylene glyc

4、ol, PEG是乙二醇的多聚化合物，是存 在一系列不同分子量的多聚體。PE柯誘導細胞間的融合，主要有兩方面的原因： 第一，PE師以破壞和干擾各類細胞的膜結構，使兩細胞相互接觸部位的膜 脂雙層中磷脂分子發生疏散， 進而使其結構發生重排， 再加上膜脂雙層的相互親 合以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質膜在修復時相互合并在一起 , 使兩細胞的胞質溝通 ,從而造成相互接觸的細胞之間發生融合。第二，PEG 可與水分子借氫鍵結合，在高濃度的 PEG 溶液中自由水消失，導致細胞脫水而發生 質膜結構的變化，引起細胞融合。為了發揮 PEG 促進細胞融合的效力，必須采 用較高濃度的 PEG 溶液，但在高濃度

5、 PEG 溶液下，細胞可能因脫水而受到顯著 的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是 PEG 融合技術的關鍵。利用PEG誘導細胞融合，其融合效果受以下幾個因素的影響：1. PEG勺分子量：細胞融合效果與PEG勺分子量成正比，但PEG勺分子量越大， 對細胞的毒性就越大。在實驗時常常采用的 PEG子量一般為8001000。2. PEG勺濃度：細胞融合效果與PEG勺濃度成正比，但PEG勺濃度越高，對細胞 的毒性就越大。在實驗時常常采用的 PEGS度一般為4060%。3. PEG勺pH值：經驗證，PEG勺pH值在8.08.2之間融合效果最好。4. PEG勺處理時間：處理時間越長，融合效果越好，

6、但對細胞的毒害也就越大。 故一般將處理時間限制在 15分鐘。5. 融合時的溫度：由于生物膜膜的流動性與溫度成正比，故細胞的融合效果也 與溫度成正比。為了獲得更好的融合效果 ,在細胞可能承受的溫度范圍內可適當 提高處理的溫度。對于哺乳動物的細，一般采用的溫度為3840 C。本實驗所用 材料為雞的血細胞，這是因為 :1）.雞血細胞具有細胞核，便于對融合細胞進行鑒 別；2）.實驗材料便宜、易得。細胞融合與否，可通過觀察細胞內核的數目來進 行鑒別。細胞內只有一個核，為未融合細胞；有二個至多個核，為融合細胞。三 實驗材料1. 材料用 Alsever 液懸浮的雞血紅細胞2. 器材 普通光學顯微鏡、離心機、

7、離心管、滴管、載玻片、蓋玻片。3. 試劑Alsever 液（pH7.4）、0.85%生理鹽水、GKN 液、50% PEG四 實驗步驟1. 取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液（4°C下保 存）。（已由老師完成）2. 取上步中所得懸液 1ml+4ml 0.85%的 NaCl 溶液，進行以下離心處理：1200r/min 離心 5min。3. 將上步的沉降血球（去上清液后，約 0.1-0.2ml）,加入GKN液至1-2ml,使 之成10%勺細胞懸液。4. 取上述10%勺血球懸液1ml,加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000000個， 即

8、1.5X 107個/ml。5. 取步驟4中所得懸液，按以下三種方式進行混勻，滴片，2-3min后觀察：（1）1ml+0.5ml 50%的PEG液（這一管標記為1號）（2）0.5ml+0.5ml 50%的 PEG液 （這一管標記為 2 號）；（3）0.5ml+1ml 50%的 PEG液 （這一管標記為 3 號）。觀察在不同PEG液濃度下的細胞融合情況，并說明，細胞融合率是否隨著PEG 液濃度的升高而逐漸提高。五. 實驗結果1. 細胞融合觀察:初步相接範為一體發生變形2. 不同PEG濃度下，細胞融合率的比較：據實驗觀察比較：1ml+0.5ml 50%的PEG誘導的細胞融合率與 0.5ml+0.5m

9、l 50%的PEG誘導的細胞融合率都很低，而0.5ml+1ml 50%的PEG誘導的細胞融合 率明顯高于前兩組。于是，可得出結論：在一定的 PEG濃度范圍內，隨PEG濃度 的升高，細胞的融合率隨之升高。六. 結果分析從實驗結果可知，雞血紅細胞之間出現了不同程度的融合現象，并且隨著 PEG濃度的升高，融合率也隨之提高?？傮w來說融合率還是不錯的。主要原因如 為：PEG的分子量、濃度、與PH值較為適合誘導細胞的融合，與雞血紅細胞懸 濁液接觸時間適宜， 向混合液中吹氣泡，使PEG與雞血紅細胞充分接觸，以至 于達到了比較高的細胞融合率。由于PEG的作用，一些細胞發生變形，因為 PEG有凝集作用，紅細胞發

10、生 多細胞的凝集反應。七. 注意事項1. 放置離心管的時候一定要對稱放置，這樣才能轉起來，保證不偏；2. 開啟離心機的時候一定要將蓋子蓋上，保證安全；3. 在制備雞血紅細胞時要反復離心洗滌制備的雞紅細胞液以清洗掉雜質；4仔細標記好試管，以免出錯；5. 鏡下觀察時要注意區分重疊細胞和融合細胞；6. PEG加到細胞懸液中2-3min后，用滴管向內部吹氣，使PEG與細胞懸液均勻 混合，以達到比較高的融合率；7. PEG對細胞融合的作用效果與毒害作用隨著分子量的增加而增大，實驗中由于不要求對融合的細胞進行進一步的培養，可以選擇分子量較大的PEG本實驗中PEG分子量為4000。8. PEG對細胞融合的作

11、用效果和毒害作用隨著濃度的增加而增大。在實驗過程中一般采用40%-60%濃度的PEG溶液，PEG的濃度以50%為好。9. PEG的PH值應控制在8.08.2之間。八. 實驗心得通過本次實驗，我懂得了聚乙二醇誘導細胞融合的原理和方法， 并成功的完 成了實驗。細胞融合是生物學中一項基本的實驗技能，是未來從事有關生物方面 的研究所必備的基本素養。在實驗過程中，我體會到了其中的樂趣，也激發了我 對科學研究的熱情。上了這次實驗課，我受益匪淺。PS:單克隆抗體的制備及應用單克隆抗體的制備1、 免疫動物 免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按

12、照預先制定的免疫方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。2、 細胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟， 在平皿內擠壓研磨， 制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。3、 選擇性培養 選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成 DNA 而死亡。未融合的

13、淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。4、 雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生所需單 克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免 疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后

14、，及時進行凍存。5、 單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內誘生法和體外培養法。(1) 體內誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射 0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。(2) 體外培養法將雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。近年來，各種新型培養技術和裝置不斷出現，大大 提高了抗體的生

15、產量。單克隆抗體的應用1 檢驗醫學診斷試劑作為檢驗醫學實驗室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性好等優點， 廣泛應用于酶聯免疫吸附試驗、放射免疫分析、免疫組化和流式細胞儀等技術。并且單克隆抗體的應用，很大程度上促進了商品化試劑盒的發展。目前，應用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應用于： 病原微生物抗原、抗體的檢測； 腫瘤抗原的檢測； 免疫細胞及其亞群的的檢測； 激素測定； 細胞因子的測定。單克隆抗體對抗原的識別， 與多克隆抗體有很大的不同。 不同試劑盒因使用的單克隆抗 體不同，識別抗原的位點不同， 導致檢測結果有一定差異。因此， 標準化問題還需要進一步 研究。2 蛋白質的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質(如 Speharose 2B、4B、6B等)上，并制備成層析柱。當樣品流經層析柱時，待分離的抗原可 與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其余成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫后， 改變洗脫