1、 實驗研究糞便基因組DNA 提取方法比較及在沙門菌定量PCR 檢測中的應用3岳昌武, 呂玉紅, 劉坤祥, 陳公安(遵義醫學院中心實驗室, 貴州563003摘要:目的建立并優化1種可用于臨床微生物檢測的糞便微生物基因組DNA 提取方法并應用于沙門菌定量PCR 快速檢測。方法分別利用土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒法、微生物基因組DNA 提取試劑盒法和本實驗室改進酚/氯仿抽提法提取腹瀉患者糞便基因組DNA , 根據沙門氏菌16srDNA 、d T 等基因或DNA 功能區序列設計PCR 引物, 進行多基因定量PCR 檢測。結果3種方法提取的基因組DNA 均可進行有效的定量PCR 擴增, 采用所建立

2、的多重PCR 方法可特異鑒別糞便沙門氏菌。結論本研究改進的糞便基因組DNA 提取方法及臨床微生物的定量PCR 檢測可在較短的時間內實現對大量臨床樣品快速診斷, 有一定應用前景。關鍵詞:基因組DNA 提取; 糞便; 定量PCR ; 沙門菌中圖分類號:R378.22;R446. 13文獻標識碼:A文章編號:167128348(2009 2423157203Comp arison of three protocols for extraction of total fecal DNA and identif ication of S almonella with real time PCRYU E

3、Chang 2w u , L U Yu 2hong , L IU Kun 2x iang , et al.(Cent ral L ab of Zunyi Medical College , Zuny i , Guiz hou 563003, China Abstract :ObjectiveTo investigate the effects of different fecal DNA extraction methods on the analysis of the diver 2sity of getting diarrhea. Methods Three protocols were

4、used to extract total rom an with diarrhea. The products of DNA were evaluated by agarose gel electrophoresis and of d T fermentation of the three DNA isolation protocols were compared. R esults were all amplified by the primer of S rRNA gene and d T fermentation DNA isolation methods have different

5、 effects on the amplification of DNA DNA extraction from fecal samples ,the SY BR Green real 2time PCR could in fecal samples for Salmonell.K ey w ords :;fecal ;real time PCR ;Salmonella目前沙門菌的檢測方法仍為依靠生化反應和血清學實驗。近年來, 分子生物學技術中的定量PCR 技術以其敏感、特異、簡便、快速、可以定量等優點被越來越多地應用于糞便微生物檢驗, 但在人類腸道的微生物群落組成非常復雜, 菌群與宿主的健康

6、和疾病有密切的關系, 糞便中微生物生態分布是臨床腸道疾病診斷的重要依據1。由于目前很多腸道微生物的生長條件尚不明了, 導致不可或很難培養, 加之純培養還要考慮到微生物對培養基的選擇性、嚴格的厭氧條件等等, 在培養時間和培養成本上消耗較大, 不僅增加了患者經濟負擔, 還可能延誤疾病治療時機, 甚至誤診。因此希望能夠直接提取糞便中腸道微生物的DNA 進行系列的分子生物學研究, 分析其微生態組成, 為臨床疾病診斷提供科學依據。由于糞便中所含雜質太多, 不僅含有動物腸道脫落細胞, 而且含有腸道微生物、未消化的食物、消化酶、黏液、膽堿、膽紅素、植物多糖等, 這些雜質不但易導致目標DNA 的降解, 還對P

7、CR 反應有強烈的抑制作用225。因此, 優化建立1種快速、高效、經濟的DNA 提取方法勢在必行。本文比較了不同類型的糞便微生物提取方法, 并利用DNA 提取物進行了針對沙門菌屬保守基因16srDNA 及d T 等基因或DNA 功能區序列設計定量PCR 引物, 優化了定量PCR 檢測條件, 建立了檢測沙門菌屬的定量PCR 檢測方法, 并進行了臨床病例沙門菌PCR 檢測方法的應用性研究。1材料與方法1. 1材料1. 1. 1菌株都伯林沙門菌(臨床分離株 由遵義醫學院第一附屬醫院微生物檢驗實驗室提供。1. 1. 2試劑與儀器土壤基因組DNA 提取試劑盒購自歐米伽公司(Omiga ,USA , 微生

8、物基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根公司(北京 、DNA Maker 等試劑購自北京賽百盛公司, 引物由北京賽百盛公司合成, 定量PCR 試劑盒SY BR TMPremix Ex TaqTM 購自寶生物公司(大連 , 其他生化試劑均購自上海生工公司。細菌裂解液(150mmol/L NaCl ,100mmol/L ED TA , p H8. 0 、細菌裂解液(100mmol/L NaCl ,0. 5mol/L Tris 2HCl p H8. 0 及細菌裂解液(0. 2mol/L NaO H ,0. 1%SDS 。Icycler IQ 型定量PCR 擴增儀購自百樂公司(Bio 2Rad , US

9、A , 紫外分光光度計為貝克曼DU800型(Beckman ,USA , GEN ETOOL S 凝膠圖像分析系統購自基因公司(G ene ,USA , Eppendorf 5406型冷凍離心機購自Eppen 2dorf (USA 。1. 1. 3引物合成根據參考文獻628, 結合Genbank 公布沙門氏菌16srDNA 、d T 等基因或DNA 功能區序列設計合成下75133基金項目:貴州省衛生廳科學技術基金資助項目(gzwkj2008212037 。 列引物。16srDNA (沙門氏菌通用 為16s rDNA R (下游引物 :52CCG T GC T TC A GT TCC A G T

10、 GT G 23,16srDNA F(上游引物 :52GT G GCG GAC GGG T GA GTA A 23, PCR擴增產物長度231bp 。d T 擴增引物(沙門氏菌通用 為d T F(上游引物 :52GTA A GG GTA A T G GGT TCC 23; d T R (下游引物 :52CACA T TA T TCGCTCAA T GGA G 23,PCR 擴增產物長度為289bp 。1. 1. 4臨床標本收集2008年11月至2009年3月就診的臨床腹瀉病例39例, 其中經臨床確診曲都柏林沙門菌感染6例, 以保存的此6例患者腹瀉物為原料。1. 2方法1. 2. 1標準菌株準備

11、及細菌總DNA 提取將菌種在麥康凱平板上劃線,37培養16h , 挑取典型單個菌落接種于LB 肉湯中,37過夜振蕩培養。取過夜振蕩培養的菌懸液1mL , 以上述天根公司細菌基因組提取試劑盒法提取總DNA (按DNA 提取試劑盒說明書進行 。紫外分光光度計檢測所制備DNA 的260nm 吸光值, 計算OD260/OD80, 預測DNA 純度及含量, 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后, 置于-80冰箱長期保存。1. 2. 2糞便標本基因組DNA 提取分別取5g 糞便于50mL離心管中, 以40mL PBS 懸浮, 渦旋震蕩10min 。500r/min 離心5min 。小心吸取上層渾濁液體, 轉移到新的5

12、0mL 離心管中,5000r/min 離心10min , 棄上清液, 分別取1g 沉淀(濕菌 分別加入0. 1g 玻璃珠(直徑0. 5mm , 以下述3DNA 。本實驗室改進酚/氯仿抽提法(方法1 :1g沉淀(濕菌 于15mL 離心管中, , 5min , 加入1mL , 1mL 顛倒混勻10次, /(25241 , 輕柔顛倒混勻10次, 70,10min ,11000r/min , 室溫離心5min 。小心轉移上清液至另一新15mL 離心管中, 加入2倍體積無水乙醇, -20放置10min , 11000r/min , 4, 離心10min , 沉淀以75%乙醇5mL 洗2次, 自然風干,

13、加入50LTE (或dd H 2O 溶解沉淀, 將溶液小心轉移至DNA 凝膠回收試劑盒所附DNA 結合柱中心, 靜止5min ,10000r/min 離心2min , 所得溶液即為糞便樣品基因組DNA 。微生物基因組DNA 提取試劑盒法(方法2 和土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒法(方法3 分別按其試劑盒說明書進行。將上述3種方法分別提取的DNA 以紫外分光光度計檢測260nm 吸光值, 計算OD260/OD80, 計算DNA 純度及含量,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后, 置于-80冰箱長期保存。1. 2. 3PCR 擴增9取DNA 模板1L (50ng/L , SY BR TM Premix E

14、x Taq TM 10L , 引物(10mol/L 各1L 、總反應體積為20L 。95預變性3min ; 95變性5s , 60退火加延伸20s , 共45循環; 最后72延伸2min 。在每一個擴增循環的溫度段結束后檢測熒光強度; 最后進行熔解曲線監測, 即完成上述最后一個循環后, 溫度升至95, 立即降溫至55, 保溫45s 后以0. 2/s 的升溫速率逐漸升至95, 在此升溫過程中進行熒光強度的連續檢測退火溫度。反應完畢后擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進一步鑒定。1. 2. 4特異性檢測按同樣的定量PCR 反應條件, 對經傳統方法驗證的曲都柏林沙門菌進行定量PCR 特異性檢測。利用實驗室

15、保存的非沙門菌株進行PCR 特異性驗證。2結果2. 1不同方法提取基因組DNA 質量比較分光光度法測定A60/A280比值在1. 62. 0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示, 3種方法均能有效獲得糞便微生物基因組DNA , 根據與DNA maker 比較(以灰度值為判定標準 , 同樣樣品量的條件下, DNA 產量由高至低依次為方法3、方法1、方法2, 然而方法1和方法2提取總DNA 中均有較多RNA 殘留。樣品DNA 條帶清晰、整齊。與方法2和方法3相比, 方法1提取的總DNA 在電泳圖中主條帶后方尚出現第二個模糊條帶, 可能是腸道脫落細胞DNA (圖1 。2. 2定量PCR 檢測沙門菌的特異性定

16、量PCR 擴增結果表明,3種不同方法提取的總DNA 都可以有效的進行定量PCR 擴增,16SrDNA 出現的CT 值較小,d T 出現的CT 值較大, 提示基因組中16SrDNA 拷貝數大于d T 拷貝數(圖2C 。從擴增熔解曲線可以看出, 呈現出典型的熔解峰, 擴增目標基因的熔點值Tm 為85(16SrDNA 和87(d T fermentation , 檢測結果為陽性(圖2A 、B 。與陽性對照曲都柏林沙門菌所顯示結果完全一致, 陰性對照大腸桿菌結果為陰性。陰性對照水也未出現特異性熔解峰, 。以上結果表明:本試驗設計的合于SY 實時PCR 擴增的T M :DNA分子量標準250bp DNA

17、 lader ;1:方法1;2:方法2;3:方法3。圖13種不同方法提取的糞便基因組DNA 質量比較A :16srDNA 的PCR 融解曲線; B :d T 的PCR 融解曲線; C :16srDNA 和d T 的PCR 擴增曲線(1為16srDNA ,2為d T ,3為負對照 。圖2糞便總DNA 定量PCR 擴增結果8513 3討論由于糞便中所含雜質太多, 不僅含有動物腸道脫落細胞, 而且含有腸道微生物、未消化的食物、消化酶、黏液、膽堿、膽紅素、植物多糖等, 這些雜質易導致目標DNA 的降解。因此, 在動物糞便DNA 提取技術中, 如何保證產物的純度和濃度, 是實驗成敗的關鍵。目前, 各種糞

18、便DNA 提取方法都圍繞怎樣除去這些雜質而得到高純度且足夠的目的基因組而展開。但是, 在糞便DNA 提取過程中, 隨著純化次數和純化步驟的增加, 難以避免的造成DNA 量上的損失9。本研究比較了目前評價較好歐米伽土壤總DNA 提取試劑盒、天根微生物DNA 提取試劑盒和本實驗室改良的酚/氯仿法提取總DNA 等3種方法, 并用臨床確診病例進行定量PCR 擴增沙門菌特異基因16srDNA 、d T 等PCR 引物進行擴增驗證, 39例腹瀉病例中經臨床確診為曲都柏林沙門菌感染6例均能通過PCR 擴增出上述2個基因的相應片段, 符合率為100%, 方法3效果最好, 同時天根試劑盒法和作者建立的方法提取總

19、DNA 進行的擴增, 各有1個病例未能有效擴增出16srDNA 相應片段, 但d T 相應片段均能得到有效擴增。這可能是歐米伽試劑盒在裂菌提取總DNA 后, 增加相應的試劑和處理步驟, 大大的降低了提取物中可能會抑制PCR 等分子生物學操作的作用效果。這種現象還提示作者, 在以糞便等復雜原料進行核酸提取及后續的分子生物學操作中, 靶基因不同, 其作用效果也可能不一樣, 具體到臨床PCR 或酶切等分子診斷時, 以大大降低誤診的風險, 提高檢出效率, 當的稀釋所得DNA 濃度, 的檢出效果, 也就是說, , 可以考慮將所得PCR 擴增, 可。(致謝:本研究受貴州省衛生廳科學技術基金(gzwkj20

20、08210237 資助, 標本采集得到遵義醫學院附屬醫院檢驗科微生物檢驗室陳澤慧副教授大力協助, 特此一并致謝! 參考文獻1趙健元, 李進華. 一種高效的哺乳動物糞便DNA 提取通用方法J.激光生物學報,2008,17(5 :696.2鐘華, 賴旭龍, 魏榮平, 等. 一種從大熊貓糞便中提取DNA 的改進方法J.動物學報,2003,49:670.3李萬水, 陳松, 涂政. 糞便DNA 提取及檢驗J.中國法醫學雜志,2004,19(4 :219.4楊德君, 吳襟, 劉毅, 等. 一種快速提取腸道微生物總DNA 的方法J.中國微生態學雜志,2006,18(2 :91.5李業鵬, 鐘凱, 楊寶蘭,

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