1、中國體視學與圖像分析2013年第18卷第1期CHINESE JOURNAL OF STEREOLOGY AND IMAGE ANALYSIS Vol18No1March201367文章編號:10071482(20130100670072生物醫學利用熒光素酶標記的腫瘤細胞建立活體成像動物模型張繪宇1,鄭國兵2,張金棟2,劉啟才2(1.廣州醫學院病理教研室,廣州510182; 2.廣州醫學院實驗醫學研究中心,廣州510182摘要:目的建立穩定表達熒光素酶的人乳腺癌細胞株并構建適用于小動物活體成像系統觀察的裸鼠皮下移植瘤模型。方法采用脂質體將攜帶熒光素酶基因的質粒轉染到人乳腺癌細胞株MCF-7中,G

2、418篩選出穩定表達熒光素酶的單克隆細胞株。擴增后接種于裸鼠,建立裸鼠皮下移植瘤模型,通過活體動物成像系統監測腫瘤的生長過程。結果獲得了高水平穩定表達熒光素酶的乳腺癌單克隆細胞株,該單克隆細胞株與母細胞系MCF-7具有相似的生長特性。將穩定表達熒光素酶的克隆接種于裸鼠皮下可成瘤,小動物活體成像系統能準確監測腫瘤細胞在體內的生長過程。結論成功建立了穩定表達熒光素酶的乳腺癌單克隆細胞株。采用活體動物成像系統構建的裸鼠皮下移植瘤模型是拓展腫瘤體內生長、轉移及治療相關研究的理想模型。關鍵詞:熒光素酶;生物發光;移植瘤;活體成像;裸鼠中圖分類號:R73文獻標識碼:AEstablishment of a

3、nude mouse model of in vivo bioluminescenceimaging generated by luciferase-labeled cancer cellsZHANG Huiyu1,ZHENG Guobin2,ZHANG Jindong2,LIU Qicai2(1.Department of Pathology,Guangzhou Medical College,Guangzhou510182,China;2.Experimental Medicine Research Center,Guangzhou Medical College,Guangzhou510

4、182,ChinaAbstract:Objective To establish a mouse model of in vivo bioluminescence imaging by subcutaneous inoculation of luciferase-labeled human breast cancer cells into nude miceMethods Recombinant plas-mid containing luciferase gene was transfected into human breast cancer cell line MCF-7cells,an

5、d a mon-oclonal cell line stably expressing luciferase was screened outThe cultured cells were subcutaneously in-oculated into nude mice to establish mouse models of transplanted tumors,and the tumor growth was moni-tored by in vivo animal imaging systemResults A monoclonal cell line stably and high

6、ly expressing lu-ciferase was obtainedThe cell line showed similar growth characteristics of the original human breast cancer cell line MCF-7cellsThe cell clone stably expressing luciferase was subcutaneously inoculated in-收稿日期:2013-01-14基金項目:廣東省自然科學基金(06301124作者簡介:張繪宇(1964,女(漢,河北廊坊人,副教授。研究方向:腫瘤病理及多

7、媒體教學。通信作者:劉啟才,副教授。E-mail:Liuqicai96868中國體視學與圖像分析2013年第18卷第1期to nude mice and subcutaneous tumors were formedThe in vivo tumor growth characteristics were closely monitored with small animal imaging systemConclusions A monoclonal cell line stably expressing lu-ciferase is successfully establishedThe

8、nude mouse models of subcutaneous transplanted tumor generated by inoculation of those luciferase-expresssing cells can be well monitored with in vivo animal imagine sys-tem,and provide ideal models for researches on tumor growth,metastasis,and treatmentKey words:luciferase;bioluminescence;transplan

9、table tumor;in vivo imaging;nude mice0引言乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,在我國許多大中型城市,乳腺癌已居女性惡性腫瘤死亡率的首位。乳腺癌復發轉移是導致乳腺癌患者死亡的最主要原因,淋巴結陰性的患者中約有24% 30%出現復發轉移,淋巴結陽性的患者中復發轉移率高達50% 60%,而轉移性乳腺癌的5年生存率僅為26%1。尋找有效的藥物用于轉移性乳腺的治療是目前迫切需要解決的難題。螢火蟲熒光素酶(Luciferase是一種常用的信號分子,可以用來標記腫瘤細胞24。使研究人員能夠通過活體成像系統直接觀察細胞在體內的生長、轉移及對藥物的反應等。特別是在腫瘤的研究中

10、,能夠無創傷定量對動物體內的原位癌、轉移癌進行直接快速檢測和測量5。本研究將帶有熒光素酶報告基因的真核表達重組質粒pRc/CMV2-luc轉染人乳腺癌細胞株MCF-7,利用G418篩選,獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆(MCF-7-luc,并在體外評價其發光能力。通過建立裸鼠移植瘤模型,利用活體生物發光成像系統檢測腫瘤生長及轉移情況,為下一步監測裸鼠移植瘤對藥物作用的變化情況,從而為分析藥物對腫瘤的治療效果提供理想的實驗動物檢測平臺67。1材料與方法11材料111試劑和儀器DMEM/F12培養基、胎牛血清、G418和Lipo-fectamine TM2000購自美國Invitrogen公司;

11、Luciferase Assay System和Luciferin(in vivo Grade購自美國Promega公司;細胞計數儀Z2coulter購自美國BECKMAN COULTER公司;熒光素酶檢測系統GLOMAX96micro plate luminometer購自Promega公司;活體成像系統Night OWLLB983NC100購自德國Berthold公司。112細胞和動物人乳腺癌細胞株MCF-7和重組質粒pRc/ CMV2-luc由廣州醫學院實驗醫學研究中心提供8;4 5周齡BLAB/c nu/nu裸鼠購自廣東省醫學實驗動物中心(SCXK(粵20080002。12方法121G

12、418最佳篩選濃度的確定MCF7細胞常規培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基。取對數生長期MCF7細胞,按每孔1104個接種于12孔板中,置于5%CO2、飽和濕度、37細胞培養箱中常規培養。G418按0、200、400、600、800、1000g/ml設置6個濃度梯度。在細胞接種24h后,加入孔板中,每個濃度設置2個復孔。每天觀察細胞生長情況,在10 14d內全部死亡的最低G418濃度,即為篩選質粒轉染克隆MCF 7細胞的濃度。122細胞轉染取對數生長期的MCF7細胞,將細胞接種于6孔培養板中,24h內待細胞融合度達到80% 90%即可轉染。按照Lipofectamine TM2000試劑

13、盒操作指南進行轉染。在250l無血清、無雙抗的DMEM培養基中加入8g/ml的pRc/CMV2-luc質粒,在250l無血清、無雙抗的DMEM培養基中加入10l Lipofectamine TM2000,室溫培育5min。將上述2種稀釋液混勻,室溫培育30min后加入細胞孔板2013年第18卷第1期張繪宇等:利用熒光素酶標記的腫瘤細胞建立活體成像動物模型69中,置于培養箱常規培養。123單克隆細胞篩選轉染24h后胰酶消化細胞并按16比例接種到新6孔板中,同時加入實驗確定的濃度G418,隨后每2d更換一次培養基并維持G418篩選直至單細胞抗性克隆的出現。分別挑選單一抗性克隆至96孔板,待其逐漸增

14、殖后轉入24孔板中繼續傳代培養。124熒光素酶活性鑒定陽性克隆單一抗性克隆傳代至第五代時用Luciferase As-say Aystem檢測熒光素酶活性。檢測時,各克隆按1105個/孔接種到24孔板,24h后細胞裂解液裂解,收集裂解物,12000rpm,4離心10min,取上清10l加入96孔白板中,向每孔加入50l熒光素酶底物,停留2s后,96microplate luminometer連續讀取10s的熒光值(RLU,每個克隆設3個復孔,保留RLU值高的細胞克隆繼續傳代培養,再過5代后進行熒光素酶活性檢測。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代,熒光素酶活性最高的幾個克隆MCF-7-luc

15、即為陽性克隆。125各不同數量細胞克隆的熒光值檢測將篩出的MCF-7-luc陽性克隆細胞按細胞數4104、2104、1104、5000、2500、1250、625、312和156分別接種到96孔黑板中,另外一組僅有細胞,一組僅有培養基作對照,設置2個復孔,常規培養24h后,去上清并用PBS洗兩次,每孔加入100l PBS,再加入D-Luciferin使其終濃度為150g/ml,立即用活體成像系統檢測,分析發光強度與細胞數之間的相關性。126細胞生長曲線繪制取表達熒光素酶的MCF-7-luc細胞和作為對照的MCF-7細胞,接種于24孔板,接種密度為2104/孔。細胞接種后1 7d,每天胰蛋白酶消

16、化其中3孔細胞,用細胞計數儀測定細胞數。以細胞生長天數為橫坐標,細胞數目為縱坐標,分別繪制兩種細胞生長曲線。127BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/c nu/nu裸鼠,4 5周齡,體重(152g,雌雄各3只。取對數生長期的MCF-7-luc克隆細胞,用PBS重懸為25107/ml懸液,每只裸鼠左右背側近腋部皮下接種100l,共接種6只。接種后第5d采用德國BERTHOLD公司的活體成像系統檢測信號強度。以后每5d觀測一次,連續觀測30d。觀測前每只裸鼠戊巴比妥鈉麻醉(計量為:35mg/kg體重,按150mg/kg體重的量腹腔注射luciferin(in vivo grade,10m

17、in 后,進行活體成像觀察皮下腫瘤的生長情況,定量分析各時間點的熒光值。繪制腫瘤皮下生長曲線。128MCF-7-luc細胞裸鼠皮下移植瘤的病理形態學觀察MCF-7-luc細胞裸鼠皮下接種后25d,脫頸處死小鼠,取腫瘤組織,制成石蠟切片,切片厚度為3m,經HE染色后觀察細胞的病理形態學。2結果21穩定表達熒光素酶的MCF-7細胞系(MCF-7-luc的鑒定結果經G418濃度梯度篩選,確定MCF-7細胞的最佳G418篩選濃度為800g/ml,pRc/CMV2-luc 質粒轉染MCF-7后經800g/ml的G418篩選2周后出現單一抗性克隆,挑選48個單克隆至96孔板后繼續擴大培養并傳代,至第5代時

18、利用熒光素酶活性檢測,共篩選出11個RLU值較高的抗性克隆(圖1。通過熒光素酶活性檢測進一步逐步淘汰,最后傳至30代時得到RLU最高的3個克隆clone26、clone27、clone29作為陽性克隆, RLU值依次為:34105、27105、13105,如圖2所示 。圖1MCF-7-luc的熒光素酶鑒定70中國體視學與圖像分析2013年第18卷第1期 圖2MCF-7-luc 的不同代數的熒光素酶值22體外培養各濃度梯度MCF-7-luc 活細胞的熒光值檢測結果采用倍比稀釋法測定9個濃度梯度細胞的熒光值。活體成像系統nightOWL indigo 軟件進行圖像采集和數據分析,結果顯示體外活體細

19、胞檢測最少細胞數為156個,而且隨著細胞的增加,光子數和細胞數量呈正相關,相關系數R 2=0986(圖3。 圖3體外培養各濃度梯度MCF-7-luc 活細胞的生物發光成像23穩定表達熒光素酶的MCF-7細胞系的生長特性細胞計數觀察MCF-7細胞和表達熒光素酶的MCF-7-luc 細胞的生長情況。MCF-7-luc clone26、MCF-7-luc clone27和MCF-7有相似的生長趨勢(圖4。可見,穩定表達Luciferase 的細胞株在構建過程沒有對MCF-7細胞的生長特性產生較大影響。圖4MCF-7-luc 和母細胞MCF-7的生長曲線的比較24裸鼠皮下移植瘤模型的建立MCF-7-l

20、uc clone26細胞對BLAB /c 裸鼠左右背側近腋部皮下接種后第5d 通過活體成像系統能檢測到腫瘤細胞的生物發光信號,隨著時間的延長,熒光信號逐漸增強。在接種后第20d 熒光信號達到最強(光子數=64106(圖5,隨熒光信號逐漸減弱,此時裸鼠開始消瘦,膚色變暗,出現晚期癌癥患者的惡質化現象。隨后處死裸鼠并解剖。綜上所述,MCF-7-luc 細胞能成功構建裸鼠皮下成瘤移植瘤模型,該模型能更靈敏、更直觀地反映腫瘤在動物體內的生長情況。圖5活體成像檢測皮下接種的MCF-7-luc 在裸鼠體內的生長情況25移植瘤病理形態改變MCF-7-luc 細胞移植瘤鏡下癌細胞排列巢狀、團索狀,癌細胞大小形

21、態各異,胞漿豐富,細胞核大深2013年第18卷第1期張繪宇等:利用熒光素酶標記的腫瘤細胞建立活體成像動物模型71染,核分裂象多見,腫瘤中央可見局灶壞死。與MCF-7細胞對照組沒有差別,都符合乳腺癌組織細胞特征(圖6。 圖6皮下接種MCF-7-luc 模型的乳腺癌組織學結構,示癌細胞形態(HE 4003討論活體動物成像技術是近期發展起來的一種新型影像檢測技術,是檢測動物體內分子及細胞事件的強有力手段。利用生物發光成像(BLI 可以對活體病灶的大小進行無損傷直觀準確檢測9,具有極高的檢測靈敏度及低廉的實驗費用。來源于螢火蟲的熒光素酶基因被人工分離并克隆到載體上,轉染細胞后表達的熒光素酶在ATP 、

22、氧及底物Luciferin 存在時,熒光素酶催化Luciferin 的氧化反應可以產生發光現象。生物發光優點在于安全、實時、準確,為研究腫瘤的發生、發展過程和抗腫瘤藥效動物實驗提供了科學準確的依據10。因此被廣泛用于腫瘤轉移,基因治療,干細胞示蹤等相關研究11。熒光素酶基因作為體內報告源的生物發光標記,具有靈敏、高效、易于檢測等特性。研究中標記腫瘤細胞的體外生物發光結果顯示細胞的發光強度與細胞的數目呈顯著線性關系,為判斷腫瘤的大小提供了直觀的量化數據。而要將這種標記用于活體動物成像,首先要獲得在非選擇條件下長期、穩定表達熒光素酶的細胞系。本研究利用lipofectam ine2000,將攜帶熒

23、光素酶基因的質粒轉染到人乳腺癌細胞株MCF-7中,獲得了具有穩定高表達lucifer-ase 的陽性克隆,并且證實了熒光素酶基因在MCF-7細胞中穩定表達。在體外實驗中,我們首先鑒定了MCF-7-luc 的細胞數量與發光強度具有顯著相關性,相關系數R 2=0986,并且,其發光能力強,最低可檢測到大約156個細胞。這種相關性的存在,為判斷腫瘤的大小提供了直觀的量化數據,從而為直接利用生物發光強度判斷腫瘤的生長及藥物反應等研究提供了前提12。用標記熒光素酶基因的細胞株MCF-7-luc 建立裸鼠皮下移植瘤模型。因熒光素酶基因在MCF-7細胞中表達穩定,故可以間接反映腫瘤在體內生長情況。在肉眼尚不

24、能發現腫瘤的時候即可使用該方法觀察、量化活體內腫瘤細胞的生長,這就使得在還未觸及腫瘤的情況下即可開始對動物皮下移植瘤模型進行藥物處理成為可能。利用活體動物成像技術可以連續示蹤腫瘤細胞在體內的生長情況,可以對同一研究個體進行長時間跟蹤成像,避免靠不同時間宰殺動物獲取實驗數據,降低了實驗成本以及動物組間人為操作誤差。為研究腫瘤發生、發展分子機制和藥物治療的選擇提供了新的工具。本研究建立了穩定整合luciferase 的人乳腺癌MCF-7-luc 細胞系,并建立了以該細胞系為基礎的乳腺癌裸鼠移植瘤模型,為利用活體成像技術探討乳腺癌的生長轉移機制及進行抗癌藥物的研發提供了穩定可靠、直觀、方便、靈敏的動

25、物模型。參考文獻(References 1Donato B M ,Burns L ,Willey V ,et alTreatment pat-terns in patients with advanced breast cancer who were exposed to an anthracycline ,a taxane ,and capecit-abine :a descriptive report J Clinical Therapeutics ,2010,32(3:5465542Brutkiewicz S ,Mendonca M ,Stantz K ,et alThe ex-pres

26、sion level of luciferase within tumour cells can alter tumour growth upon in vivo bioluminescence imaging J The Journal of Biological and Chemical Lumines-cence ,2007,22(3:2212283Yamasaki S ,Yamada S ,Takehara KBioluminescenceinhibition of bacterial luciferase by aliphatic alcohol ,72 中國體視學與圖像分析 ami

27、ne and carboxylic acid： inhibition potency and mechJ Analytical Sciences， 2013 ， 29 （ 1 ） ： 41 46 anism 2013 年 第 18 卷 第1 期 ZHENG Guobing，LIU Qicai， LI Xiaoyan，et al Establishment of human lung cancer cell lines stably express Progress in Modern Biomedicine， ing luciferase J 2010 ， 10 （ 5 ） ： 1658 16

28、60 （ in Chinese） 9 Notting I C， Buijs J T，Qur I，et al Whole body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis J Investigative Ophthalmology Visual Science，2005 ，46 ： 1581 1587 10 Hashida N，Ohguro N，Yamazaki N Highefficacy sitedirected drug

29、delivery system using sialyllewis x conjugated liposome J Experimental Eye Research，2008 ， 86 ： 138 149 11 Henriquez N V，Van Overveld P G，Que I，et al Advances in optical imaging and novel model systems for J Clinical Experimental cancer metastasis research 2007 ， 24 ： 699 705 Metastasis， 12 Everaert B R，Bergwerf I，De Vocht N，et al Multimodal in vivo imaging reveals limited allograft survival，intrapulmonar