1、【實驗題目】動物細胞融合【實驗目的】1. 了解動物細胞融合的常用方法。2. 學習化學融合的基本操作過程。3. 觀察動物細胞融合過程中細胞的行為與變化。【實驗材料與用品】1 、材料雞血紅細胞2 、試劑50%PEG 、GKN溶液、 Alsever s 細胞保存液、 0.85%氯化鈉溶液。3 、 器材倒置顯微鏡、離心機、載玻片、蓋玻片、離心管、廢液缸、滴管等。【實驗原理】細胞融合是指在自發或者誘導條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的過程。目前人們已經發現有很多方法可以誘導細胞融合，包括：病毒誘導融合、化學誘導融和和電激誘導融合。1、病毒誘導融合仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒

2、等可以介導細胞的融時也可介導細胞與細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導細胞發生融合。2、化學誘導融合很多化學試劑能夠誘導細胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質能夠改變細胞膜脂質分子的排列，在去除這些物質之后，細胞膜趨向于恢復原有的有序結構。在恢復過程中想接觸的細胞由于接口處脂質雙分子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質流通，發生融合。化學誘導方法，操作方便，誘導融合的概率比較高，效果穩定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是廣泛使用的化學融合劑。3、電激誘導融合包括電誘導、激光誘導等。其中，電誘導是先使細胞在

3、電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，細胞膜的脂質分子發生重排，由于表面張力的作用，兩細胞發生融合。電誘導方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機制明確、可重復性高等優點。【實驗步驟 】在本次實驗中采用的是化學誘導融合的方法， 利用 PEG使雞血紅細胞發生融合。 具體實驗步驟如下：1、取雞血 2ml+2mlAlsever 液，再加入 6mlAlsever 液，混勻后制懸液（ 4保存）【老師已做好，可直接使用】2、取（ 1）中懸液 1ml+4ml 的 0.85%的 NaCl 溶液，進行以下三次離心處理：在 1200r/min 下離心 5min，

4、去掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl 溶液至 5ml； 1000-1200r/min 下離心 5min，去掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl 溶液至 5ml； 1000-1200r/min 下離心 7min 【因時間關系此次實驗只離心一次】3、 將離心后的沉降血球（去上清后約 0.1-0.2ml ）加入 GKN至 1-2ml ，使之成為 10%的細胞懸液；4、 取上述 10%的血球懸液 1ml, 加入 3mlGKN液，使每毫升含血球15000000 個；5、分別取（ 4） 1ml+0.5ml50%PEG，（ 4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（ 4）0.5ml+1.0ml50

5、%PEG，混勻滴片，編號分別為號溶液。在常溫下2-3min 后，顯微鏡下觀察。【實驗結果 】1、 實驗中可觀察到兩個和多個細胞發生質膜融合現象, 可看到不同融合狀態的細胞：兩細胞的細胞膜相互接觸、粘連；接觸部分的細胞膜崩解，兩細胞的細胞質相同，形成一個細胞質的通道，呈現啞鈴狀；通道擴大，兩個細胞連成一體，呈現一個長橢圓形細胞； 細胞融合完成形成含有雙核或者多核的細胞，呈圓形。比較典型的細胞融合時的形態如下圖：初步接觸融合圖1圖2圖3細胞進一步融合圖4圖5圖6融合完成圖7圖82、在三種不同濃度的細胞懸液中，所觀察到的細胞發生質膜融合的比率不同，如下圖所示：圖 1：1 號溶液中細胞融合整體圖像圖

6、2：2 號溶液中細胞融合整體圖像圖 3：3 號溶液細胞融合整體圖像【討論與結論】1、 實驗結果經過 PEG的介導融合，雞血紅細胞中有少部分細胞發生了融合，且多處于融合剛開始的階段。大部分細胞仍處于離散狀態，另外，視野中還發現有細胞聚集成團的現象。另外，本次實驗進行了細胞懸液三個不同濃度的融合實驗，1ml+0.5ml50%PEG，0.5ml+0.5ml50%PEG，0.5ml+1.0ml50%PEG，前兩組的細胞融合率明顯沒有第三組的細胞融合率高，因此可以得出結論：在一定范圍內，PEG的濃度越高，細胞融合率越高。另外，由于本次實驗中的細胞懸液濃度偏低，因此無法直觀的對前兩組進行融合率的比較，但從

7、理論上分析，在 PEG濃度一定時應該是細胞濃度高的融合率高（細胞間的接觸幾率增大）。2、 結果分析本次細胞融合實驗采用的是雞血紅細胞，鳥類紅細胞存在細胞核，且細胞體積較大，易于實驗觀察。本次實驗由于時間關系只進行了一次離心，而正常實驗過程是要進行三次離心，目的是充分清洗細胞表面，使細胞接觸面積達到最大，有利于細胞間的融合。每次離心前都要將樣品小心混勻，否則有可能出現聚集成團的細胞。若視野中出現聚集成團的細胞，還有一種可能：制備的雞血紅細胞懸液濃度過高。 視野中經常會看到兩個或多個細胞接觸在一起，此時不一定就是融合的細胞，需要轉動細準焦螺旋對接觸部分進行觀察，通過觀察接觸部位細胞膜的有無判斷其為

8、融合細胞還是重疊在一起的細胞。 本次實驗采用的是PEG介導，融合效果受到以下幾個因素的影響： PEG分子的分子量和濃度、PEG作用時間、融合溫度、 PH值。在一定范圍內適當調節這些條件，可以將融合率提高。但在進行科研時還應考慮到，PEG分子對細胞存活的影響（ PEG具有一定的毒性，且分子量越大毒性越大），因此取分子量800-1000 較適合。 1 號試管中的細胞懸液出現類似血絲的懸濁物， 可能是加入 PEG之后沒有及時混合均勻， 細胞大量聚集。因此在加入 PEG后先反應 30s 左右后小心混勻，否則會導致細胞融合不充分。且在加入時盡量避免震動。附：細胞融合的應用動物細胞融合是從細胞水平來改變動

9、物細胞的遺傳性，可用于生產單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品。在培育動物新品種時，縮短動物的育種過程。動物細胞融合的應用范圍已廣及生物學的各個分支學科。動物細胞融合技術對于研究細胞分化、基因定位、腫瘤發生機制等方面都有重要意義。在實際應用方面，動物細胞融合技術在藥物定向釋放系統、細胞治療以及抗腫瘤免疫等方面起到重要的作用。1、生產單克隆抗體單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定抗原免疫刺激的B 淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞，雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B 淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術。2、用于基因定位和繪制人類基因圖譜雜種細胞中某一

10、染色體或其片段的存在與否與細胞的某一性狀表達與否相聯系，從而可以實現把基因定位于某一染色體或某一區段上。3、動物育種體細胞核移植技術是將細胞核移植到另一細胞的細胞質中的生物技術。動物體細胞融合后，雜種細胞難以發育再生為一個個體。但借助于細胞核移植的方法將融合后雜種細胞的細胞核移入去核成熟卵內，可培育新的雜種。另外，細胞核移植技術的建立，還為目前進行的哺乳動物體細胞克隆和轉基因技術做了良好的鋪墊。4、細胞療法將患者的任何體細胞與去核卵細胞融合，融合子進行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內細胞團是多能干細胞，對多能干細胞進行誘導使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來源問題，而且也避免宿主對外來物的免疫排斥。5、植物細胞融合植物細胞融合在育種上有重要的應用價值，在生產研究應用方面， 通過誘導不同種屬間甚至不同科間原生質體的融合，可能打破有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而有可能形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜交植株。植物細胞