1、動物細胞融合與單克隆抗體動物細胞融合與單克隆抗體第一節(jié)第一節(jié) 動物細胞融合動物細胞融合一、一、動物單個細胞的獲得動物單個細胞的獲得 動物細胞雖然沒有細胞壁，但細胞間的連接方式多樣而復(fù)雜，在進行有效的細胞融合之前，也必需獲得單個分散的細胞獲得單個分散的細胞。 組織的獲得 采用各種適宜的方法處死動物，取出組織塊放入小燒杯中，用剪刀將組織塊剪刀將組織塊剪碎成剪碎成1mm1mm3 3大小大小，用吸管吸取Hanks溶液沖下剪刀上的碎塊，補加35ml的Hanks溶液，用吸管輕輕吸打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。 組織的消化 通過生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細胞團或單細胞。根據(jù)不同的組織對象采用

2、不同的酶消化液。如最常用的有最常用的有胰蛋白酶和膠原酶等胰蛋白酶和膠原酶等。其他的酶如鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動物細胞的消化。EDTAEDTA最適合消化傳代細胞，常與胰蛋白酶使用。 膠原酶消化 是一種由細菌中提取的酶，對膠原和細胞間質(zhì)有較強的消化作用，適用于消化纖維組織纖維組織、上皮組織上皮組織、癌癌組織組織等。 （1）向培養(yǎng)瓶中放入15mm3大小的組織塊，加5ml 2000單位/ml的膠原酶干液，最終濃度為200單位/ml，pH=6.5。 （2）36.5水浴448小時，無需搖動，中間可更換酶液一次。 （3）當(dāng)組織變軟，分散于瓶底時，輕輕震蕩即散成細胞團或單個細輕輕震蕩即散成細胞

3、團或單個細胞胞，小心倒出培養(yǎng)液。 （4）800r/min離心5分鐘，棄上清液，重新懸浮BSS溶液中，再離心一次。 （5）加入培養(yǎng)液制成細胞懸浮液二、細胞融合的方法 細胞融合的方法包括:PEG法融合電融合病毒介導(dǎo)融合優(yōu)點優(yōu)點-成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點缺點-過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進而促使原生質(zhì)體的融合； PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質(zhì)體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。操作步驟操作步驟 融合液：

4、融合液：CaCl22H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6 誘導(dǎo)液：誘導(dǎo)液：融合液PEG 2045 稀釋液：稀釋液：A液液（g/100ml）pH6.0 葡萄糖 7.21 CaCl22H2O 0.79DMSO 10ml B液液（g/100ml）pH10.5 甘氨酸 0.375 NaOH 0.169 首先，通過雙向電泳使細胞間的接觸變得首先，通過雙向電泳使細胞間的接觸變得非常緊密非常緊密( (高頻交流電高頻交流電) )。在活細胞等微粒的內(nèi)部，誘導(dǎo)去極化，引起細胞聚集，排列成串珠狀，互相緊密接觸。 然后給予短暫的高壓脈沖，引起細胞膜的然

5、后給予短暫的高壓脈沖，引起細胞膜的穿透，隨后細胞膜發(fā)生結(jié)合導(dǎo)致細胞融合。穿透，隨后細胞膜發(fā)生結(jié)合導(dǎo)致細胞融合。為了穩(wěn)定這個過程，在短期內(nèi)需要施加交流電壓。 電融合的優(yōu)點 與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點：1、不存在對細胞的毒害問題；2、融合效率高；3、融合技術(shù)操作簡便當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。電融合中的主要參數(shù)包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理

6、時間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。3.病毒介導(dǎo)的融合 略影響細胞融合的因素 首先，細胞的質(zhì)量對細胞融合首先，細胞的質(zhì)量對細胞融合起著至關(guān)重要的作用起著至關(guān)重要的作用，高質(zhì)量的細胞是細胞融合的首要條件。 其次，融合方法其次，融合方法 其三，融合參數(shù)其三，融合參數(shù)，包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)。三、雜種細胞的篩選 原理：兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞。 1）親本 2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體 3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體 4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體 5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細胞。 6）核質(zhì)體：有細胞核而帶有

7、少量細胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體 1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞。 親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感 親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感 雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長 2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。 親本A：色氨酸缺陷型 親本B：蘇氨酸缺陷型 雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。 3）溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的培養(yǎng)細胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。

8、由此篩選雜種細胞。 親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。 親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。 雜種細胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長。第二節(jié)第二節(jié) 進入動物體內(nèi)對肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作進入動物體內(nèi)對肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細菌、各種細胞包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細菌、各種細胞等。等。特點：外源性、結(jié)構(gòu)性（分子表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)特點：外源性、結(jié)構(gòu)性（分子表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團作為識別位點）、特異性（抗原與抗體的反構(gòu)基團作為識別位點）、特異性（抗原與抗體的反應(yīng)）。應(yīng)）。2抗體動物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消

9、除抗原物質(zhì)的影響的糖蛋白，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。動物脾臟有上百萬個動物脾臟有上百萬個B B淋巴細胞淋巴細胞，一個細胞就是一個克隆，它一個細胞就是一個克隆，它針對針對抗原上的一個抗原決定簇產(chǎn)生的抗原上的一個抗原決定簇產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體抗體是單克隆抗體。一種抗原通常具有多個不同的抗一種抗原通常具有多個不同的抗原決定簇，因此能刺激多個原決定簇，因此能刺激多個B B淋淋巴細胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體巴細胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。稱

10、為多克隆抗體。人體內(nèi)的五種抗體二、單克隆抗體的制備二、單克隆抗體的制備 動物免疫與親本細胞動物免疫與親本細胞的選擇的選擇 細胞融合：淋巴細胞細胞融合：淋巴細胞雜交瘤的制備雜交瘤的制備 雜交瘤細胞的篩選：雜交瘤細胞的篩選：有限稀釋法等有限稀釋法等 單克隆抗體的制備和單克隆抗體的制備和凍存凍存 單克隆抗體的純化單克隆抗體的純化 骨髓瘤細胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶） 。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤細胞。 淋巴細胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。 免疫方法：體內(nèi)法或體外法。 體內(nèi)法：對細胞或微生物

11、抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。34天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95以上的可以用于融合。 體外法：直接提取大、小鼠淋巴細胞，調(diào)整為107個/ml，加適當(dāng)濃度抗原，34天后，收集被刺激的淋巴細胞。 細胞融合 將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心710分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG 0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入510ml不含血清的

12、培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞 細胞團塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細胞不超過2105 ml，即可加入有飼養(yǎng)細胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。 用HAT選擇性培養(yǎng)時每隔23天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。細胞融合的選擇示意圖HAT選擇系統(tǒng) HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關(guān)。 DNA合成途徑有兩種。 雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸腺

13、嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一。 HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生； TK- 細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。 含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。 淋巴細胞具有合成淋巴細胞具有合成DNADNA的兩條途的兩條途徑。徑。 雜種細胞通過互補作用獲得雜種細胞通過互補作用獲得HRPTHRPT或或TKTK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救補救合成途徑合成途徑合成合成DNADNA。 在在HATHAT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，HPRTHPRT- - 或或TKTK- - 親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸親本細胞死

14、亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有死亡，只有雜種細胞存活雜種細胞存活。特異性雜交瘤細胞的篩選 通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細胞。可取上清液，根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇。 可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶 標(biāo)測定、間接血凝等方法測定。細胞 抗原可采用免疫熒光、51Cr釋放試驗、 溶血空斑測定、補體依賴的細胞毒等 方法直接測定針對這些抗原的抗體。利用培養(yǎng)基對單抗進行鑒定的過程 利用單個細胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細胞系。 在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞 或

15、胸腺細胞等。 方法有有限稀釋法、軟瓊脂培 養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光 激活分選儀等。 通過適當(dāng)?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的 1）取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù) 2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。 3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml， 其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞。 4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞， 經(jīng)過812天后，可觀察到有集落生長的孔。 5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進行克隆化。 在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)。 1）誘生腹水 將穩(wěn)定分泌單抗的細胞株，通過擴

16、大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。 方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種35106 雜交瘤細胞。1020天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含110mg單抗。 2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進行大規(guī)模培養(yǎng)。 3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗 單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等 單克隆抗體靶向制劑：治療癌癥等疾病 雜交人鼠單克隆抗體 現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀

17、腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。 用同位素標(biāo)記的單抗在特定的組織中 成象的技術(shù)可以用于腫瘤、心血管畸 形的體內(nèi)診斷。 1）藥物與單抗直接偶聯(lián) 通過化學(xué)反應(yīng)使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。 利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。 利用羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏堿，最后還原。 這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性， 并具有一定的選擇性。 如：1，4溴柔紅霉素與腫瘤細胞單抗 形成的偶合物，對腫瘤有明顯的選擇性 毒性。 2）藥物通過小分子與單抗連接 通過一些小分子交聯(lián)劑，把藥物分子上的某些基團連接起來。 小分子交聯(lián)劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、

18、戊二酐；異型雙功能試劑：N琥珀酰胺基3丙酸和寡肽等。 順烏頭酸酐制成的最常用，在中性 條件下較穩(wěn)定，在酸性條件下容易 發(fā)生水解。這種靶向試劑與腫瘤的 表面抗原結(jié)合后，會進入溶酶體， 在酸性環(huán)境下釋放藥物，而殺死 腫瘤細胞。 3）藥物通過大分子與抗體相連 大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 總之，利用單抗試劑合可以作為靶向藥物，針對腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、各種病原體病等。3、雜交人鼠單克隆抗體 鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，還可能引發(fā)人對鼠源抗體本身的免疫反應(yīng)。 在抗體中，F(xiàn)c片段在抗體中的作用是激活機體免疫反應(yīng)。 對鼠源抗體進行改造，利用人源的Fc區(qū)域的DNA片段替換鼠源單抗的Fc的DNA片段。 嵌合抗體可以保留其目標(biāo)專一性，降低人的抗鼠反應(yīng)。 方法1：分離人B細胞，使之與熒光標(biāo)記的抗原相結(jié)合，通過熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的B細胞，并用EpsteinBarr病毒轉(zhuǎn)化，得到少量的單