1、DC-CIKDC-CIK細胞的制備及在腫瘤細胞的制備及在腫瘤治療中的應用治療中的應用 惡性腫瘤的治療現狀惡性腫瘤的治療現狀惡性腫瘤惡性腫瘤治愈治愈4545難于治愈難于治愈5555未緩解未緩解緩解后復發緩解后復發惡性腫瘤的多學科綜合治療惡性腫瘤的多學科綜合治療惡性腫瘤各種治療手段各具優勢與不足惡性腫瘤各種治療手段各具優勢與不足n腫瘤外科學腫瘤外科學n腫瘤放射治療學腫瘤放射治療學n腫瘤化學治療學腫瘤化學治療學n腫瘤生物學治療腫瘤生物學治療n側重點不同側重點不同n局部與全身局部與全身n早、中、晚期早、中、晚期腫瘤免疫學治療的優點腫瘤免疫學治療的優點n可以有效地殺滅患者術后和放化療后體內殘存的腫可以有

2、效地殺滅患者術后和放化療后體內殘存的腫瘤細胞，達到治療腫瘤、預防復發與轉移和最終根瘤細胞，達到治療腫瘤、預防復發與轉移和最終根治腫瘤的目的。治腫瘤的目的。n具有具有特異性強、適用性廣、副作用輕特異性強、適用性廣、副作用輕等優點。等優點。腫瘤免疫學治療腫瘤免疫學治療n非特異免疫刺激劑及細胞因子治療：非特異免疫刺激劑及細胞因子治療： IL2IL2、IL6IL6、IL12IL12、GM-CSFGM-CSF、TNFaTNFa、IFNaIFNa、IFNrIFNr等體內應用，裝等體內應用，裝載有細胞因子基因的細胞治療。載有細胞因子基因的細胞治療。n治療性疫苗：腫瘤抗原或多肽抗原疫苗、裝載腫瘤治療性疫苗：腫

3、瘤抗原或多肽抗原疫苗、裝載腫瘤抗原基因的病毒疫苗、基因修飾的腫瘤細胞疫苗、抗原基因的病毒疫苗、基因修飾的腫瘤細胞疫苗、APCAPC細胞疫苗、抗獨特性疫苗細胞疫苗、抗獨特性疫苗。nMabMab導向治療：導向治療： MabMab、Mab-Mab-毒素、毒素、Mab-Mab-同位素、鼠同位素、鼠- -人單抗、人源單抗、雙特異性抗體。人單抗、人源單抗、雙特異性抗體。n過繼性免疫細胞治療過繼性免疫細胞治療：供者淋巴細胞輸注、供者淋巴細胞輸注、LAKLAK、TILTIL、CIKCIK、多種方法誘導的多種方法誘導的CTLCTL、DC-CIKDC-CIK等。等。過繼免疫療法過繼免疫療法n通過把在體外擴增的大量

4、特異性效通過把在體外擴增的大量特異性效應細胞回輸給患者后，產生直接殺應細胞回輸給患者后，產生直接殺傷腫瘤細胞的作用。傷腫瘤細胞的作用。DC-CIKDC-CIK培養及其應用培養及其應用nCIKCIK細胞：細胞：Cytokine Induced Killer CellCytokine Induced Killer CellnDCDC：Dendritic CellDendritic CellCIKCIK細胞特性細胞特性n分布：肝臟和外周血分布：肝臟和外周血n來源：來源：CD3+CD56+TCD3+CD56+T細胞和細胞和CD4-CD8+TCD4-CD8+T細胞細胞DCDC與與T T細胞細胞nDCDC

5、高表達高表達MHC-MHC-類、類、類分子，類分子，MHCMHC分子分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結合，形成肽與其捕獲加工的腫瘤抗原結合，形成肽- -MHCMHC分子復合物，遞呈給分子復合物，遞呈給T T細胞，從而啟細胞，從而啟動動MHC-IMHC-I類限制性類限制性CTLCTL反應和反應和MHC-MHC-類限類限制性的制性的CD4+ ThlCD4+ Thl反應反應 ；nDCDC還通過其高表達的共刺激分子還通過其高表達的共刺激分子(B7-1(B7-1、B7-2B7-2等等) )提供提供T T細胞活化所必須的第二信細胞活化所必須的第二信號，啟動了免疫應答號，啟動了免疫應答。DCDC負載腫瘤抗原負載腫

6、瘤抗原腫瘤殺傷作用腫瘤殺傷作用n誘導抗原特異性誘導抗原特異性CTLCTL反應反應n增加增加CIKCIK細胞的擴增倍數細胞的擴增倍數n增強增強CIKCIK腫瘤殺傷效力腫瘤殺傷效力MHC：抗原提呈自分泌細胞因子：INF,IL-12等抑制CD4+CD25+調節T細胞生長CIKCIK細胞的制備細胞的制備PBMNC (CS3000 Plus)In a 3000ml Baxter bagSerum free culture mediumIFN 第一天第一天Il-2 第二天第二天CD3 mAb 第二天第二天IL 1 第二天第二天14 dayslCS-3000CS-3000采集采集PBMNCPBMNClFic

7、ollFicoll分離分離PBMC,PBMC,洗洗2 2次次l1-21-210106 6/ml/ml接種至含無血清培養基接種至含無血清培養基的培養袋中，的培養袋中，1000ml/1000ml/袋，加入袋，加入IFN-IFN-1000U/ml1000U/ml，放置，放置3737，5%5%的的CO2CO2孵箱孵箱中培養中培養24h24hl加入加入IL-1IL-1 100U/L 100U/L，CD3CD3單抗單抗50ng/ml50ng/ml，重組人，重組人IL-2 300U/LIL-2 300U/L，繼續，繼續培養，每培養，每3 3天半量換液，并補加天半量換液，并補加IL-2 IL-2 300U/m

8、l300U/ml。 l 分別于第分別于第5 5，7 7，9 9天取細胞做細胞表天取細胞做細胞表型分析（型分析（FCMFCM檢測），細胞殺傷實驗檢測），細胞殺傷實驗（MTTMTT法）法）l收集細胞，含收集細胞，含0.5%0.5%白蛋白的生理鹽水白蛋白的生理鹽水洗滌洗滌l回輸回輸CD3CD3主要促主要促CIKCIK細胞增殖，促細胞增殖，促IL-2IL-2自分泌，也提高自分泌，也提高CIKCIK殺傷活性殺傷活性IFN-r/IL-1IFN-r/IL-1，上調細胞表面，上調細胞表面IL-2RIL-2R表達，表達，IFN-rIFN-r先于先于IL-2IL-2加入，有效激活效應細胞，增強抗腫加入，有效激活效

9、應細胞，增強抗腫瘤活性瘤活性DCDC的的培養培養Tumor antigenDC-CIKDC-CIK共培養共培養+05101520251234567 cell numberdaysCIKCIK細胞的增殖細胞的增殖02004006008001000FSC-Heightmajinlan070907d9.003R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070907d9.003R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070907d9.00302004006008001000FSC-Heightmajinlan070905d6.003R110010110

10、2103104CD3 PerCPmajinlan070905d6.003R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070905d6.00302004006008001000FSC-Heightmajinlan070829d0.001R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070829d0.001R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070829d0.00162.%84.7%89.5%28.2%43.1%52.3%012253035404550556065Cytotoxixity % AML ALLlCIK細胞對自體

11、原代白血病細胞有明顯殺傷作用，且其細胞毒作用隨著效靶比的增加而進一步增強，在效靶比為20：1時，其中位殺傷率分別為51.33%,52.95%1:51:101:200102030405060 %cytotoxicitytarget:effector ratio ALL AML NHL腫瘤細胞凍融物腫瘤細胞凍融物腫瘤細胞壞死物腫瘤細胞壞死物正常生長的腫瘤細胞正常生長的腫瘤細胞無腫瘤細胞無腫瘤細胞無無DCDC-CIKDC-CIK對腫瘤殺傷作用對腫瘤殺傷作用DC-CIKDC-CIK對肝癌細胞的殺傷活性對肝癌細胞的殺傷活性* *DCDC與與CIKCIK共培養后，共培養后，CIKCIK增殖能力和殺傷活性明

12、顯增強增殖能力和殺傷活性明顯增強DC/CIK治療結腸癌血源性肺轉移的實驗研究治療結腸癌血源性肺轉移的實驗研究CIK/DC-CIKCIK/DC-CIK治療惡性血液病合并丙肝治療惡性血液病合并丙肝CIKCIK治療治療1 1例白血病合并丙肝后肝功的變化例白血病合并丙肝后肝功的變化新技術新技術nRetroNectin activated killer cell（RAK）nDC相關的技術RetroNectin activated killer cell（RAK）n重組人纖維蛋白片段(RetfoNectin)可參與細胞的附著、伸展、分化和增殖。該產品已注冊美國藥典和國際專利。n當包被在培養皿和培養瓶中時，RetroNectin能顯著提高逆轉錄病毒轉染入哺乳動物細胞內的效率。nRetroNectin還可參與細胞的附著、伸展、分化和增殖，可增加體外CIK細胞擴增倍數，及腫瘤殺傷活性。RetroNectin activated killer cell（RAK）zoledronate acid/唑來膦酸 n轉染AFP質粒的腺病毒感染DCnDC-CIK共培養n殺傷活性檢測健康供著DC和CIK肝癌患者DC和CIKCIK/DC-CIKCIK/DC-CIK