1、淺談PCR儀溫度校準(zhǔn)的必要性及方法朱晨彬，朱毅晨，姚麗芳，張麗萍，陳宇，朱學(xué)平（上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院）摘要：本文分析了PCR儀使用的現(xiàn)狀及其進(jìn)行溫度校準(zhǔn)的必要性。提出了PCR儀溫度校準(zhǔn)的方法和校準(zhǔn)項(xiàng)目（溫度準(zhǔn)確性，溫場均勻性，升降溫速率，最大超調(diào)溫度）以及數(shù)據(jù)處理方法，并分析了每一校準(zhǔn)項(xiàng)目的重要性。關(guān)鍵詞：PCR儀，溫度校準(zhǔn)，溫度準(zhǔn)確性，溫場均勻性，升降溫速率，最大超調(diào)溫度一、引言PCR1聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction）的簡稱，是在短時(shí)間內(nèi)體外大量擴(kuò)增特定的DN砧段的分子生物學(xué)技術(shù)。自動(dòng)完成聚合酶鏈反應(yīng)，提供DNA擴(kuò)增的溫度條件而設(shè)計(jì)的儀器稱為PClR/oPC

2、主要用于DN砧段的放大，可將DN冊子或某一DN射段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，在這過程中主要是3個(gè)特征溫度循環(huán)：1 .高溫變性：把樣品加熱至9095c讓DNA板變性變成單鏈。2 .低溫退火：讓樣品的溫度迅速下降至5065C,引物就可以結(jié)合到模板上去。3 .適溫延伸：讓樣品的溫度上升至7075CQNAK合酶就可以從引物開始用底物復(fù)制出新鏈。因此，在PC應(yīng)過程中對溫度控制的要求很高，良好的溫度控制是PCR：質(zhì)量好壞的關(guān)鍵。二、PCRg因擴(kuò)增儀校準(zhǔn)的現(xiàn)狀PC的控溫精度、升降溫速率以及溫場的均勻性等直接影響DN射段擴(kuò)增的結(jié)果。PCR：經(jīng)使用后，其溫度傳感器的計(jì)量特性會(huì)發(fā)生變化，作為計(jì)量設(shè)備一般須經(jīng)

3、定期校準(zhǔn)后方能繼續(xù)使用。幾乎進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室（如基因判別、親子鑒定、DN2體識(shí)別）都會(huì)使用多臺(tái)擴(kuò)增儀以滿足實(shí)驗(yàn)需求。而且，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的基因擴(kuò)增儀都是常開常用，使用頻率高，很難保證其性能指標(biāo)符合實(shí)驗(yàn)要求。各實(shí)驗(yàn)室對PCR的質(zhì)量控制還停留在自檢自校和依賴于廠商的售后支持。我院于2006年編寫了基因擴(kuò)增儀（PCFRZ）的校準(zhǔn)規(guī)范JCJ/E111025.1/0-2006,早已開展PCR：的溫度校準(zhǔn)項(xiàng)目。使用標(biāo)準(zhǔn)裝置：置名稱性能（PCR儀）校準(zhǔn)儀特點(diǎn)加熱槽溫度動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測適用工況任何工況測溫通道數(shù)16溫度測量范圍(0-110)C系統(tǒng)分辨率0.01C測溫準(zhǔn)確度0.10C米樣頻率2Hz由于需要PC

4、R：升降溫速率較快,故要求溫度傳感器的熱慣性小（滯后要小），反應(yīng)靈敏。因此，校準(zhǔn)過程使用熱敏電阻作為測溫傳感器。標(biāo)準(zhǔn)測試程序?yàn)椋涸隰◤dP溫度點(diǎn)持續(xù)時(shí)間步驟130C11:00分鐘步驟295C3:00分鐘步驟330C2:00分鐘步驟490C3:00分鐘步驟550C3:00分鐘步驟670C3:00分鐘步驟760C3:00分鐘步驟830C1:00分鐘通過專用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，并繪制溫度循環(huán)測試曲線。見圖一圖一pcr溫度循環(huán)測試曲線三、PCRZ溫度校準(zhǔn)的項(xiàng)目及必要性一個(gè)穩(wěn)定的溫度循環(huán)是成功實(shí)現(xiàn)PC所必需的。其中溫度控制的動(dòng)、穩(wěn)態(tài)特性是影響PCFT增結(jié)果正確與否白最重要因素之一,這包括溫度準(zhǔn)確性、升

5、降溫速度、溫場均勻性、最大超調(diào)溫度。（一）、溫度準(zhǔn)確性溫度準(zhǔn)確性是PC取最重要的性能指標(biāo)，如溫度準(zhǔn)確性低可直接造成非特異性擴(kuò)增，甚至是錯(cuò)誤的擴(kuò)增結(jié)果，造成假陽性和假陰性。市場上各家廠商考核基因擴(kuò)增儀（PCRZ）性能的主要指標(biāo)，一般廠家的企業(yè)指標(biāo)為0.5C,一些性能較好的產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)的溫度準(zhǔn)確度為土0.3C。故需對PCRZ控溫準(zhǔn)確度進(jìn)行測試。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)平均溫度的計(jì)算公式為:I一參加檢測的溫度探頭序號；n一參加檢測的溫度探頭的數(shù)量（二）、溫場均勻性由于PC雙加熱器加熱不均勻，導(dǎo)致PCRZ模塊上各孔存在一定溫差。造成試驗(yàn)結(jié)果偏差。一般PC雙邊緣點(diǎn)的溫度低于中間區(qū)域，所以均勻性為PCRZ重要的性能指標(biāo)。

6、一般廠家的企業(yè)指標(biāo)規(guī)定均勻性為0.5C,一些性能較好的產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)的溫度均勻度為0.3C。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過選取孔板中16個(gè)特殊反應(yīng)位置（如圖2所示）來測量溫度，并得出孔板的溫度均勻性。均勻性為各個(gè)探頭在同一時(shí)刻最大溫度與最小溫度的差值。均勻度計(jì)算公式為：tma息min（tmax=最大溫度；tmin=最小溫度）Euofoolayout（圖二96孔板探頭布點(diǎn)示意圖（三）、升降溫速率PCRT增產(chǎn)物數(shù)量白多少?zèng)Q定了PCR勺效率。為了在短時(shí)間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)物，需要儀器在升降溫段具有按照預(yù)設(shè)升降溫速率快速升溫和降溫的能力（最大升溫速率達(dá)1520C）。一個(gè)完整的PCRi程，是由若干個(gè)升溫一恒溫一降溫循環(huán)

7、構(gòu)成的。因?yàn)椤白冃浴保巴嘶稹焙汀把由臁?個(gè)階段是必須要保證的。因此，只有使升降溫的過程盡可能地迅速，才能縮短每個(gè)PCR1環(huán)以及整個(gè)PCR過程所需時(shí)間。一般廠家的企業(yè)指標(biāo)規(guī)定升溫速率為3C/sec。儀器校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，升溫速率為溫度從40c到90c的時(shí)間；降溫速率為溫度從70c至ij35c的時(shí)間。詳見圖三圖三PCR降溫速率計(jì)算示意圖（四）、最大超調(diào)溫度當(dāng)溫度從一定點(diǎn)溫度調(diào)節(jié)到另一定點(diǎn)溫度，就會(huì)產(chǎn)生溫度的超調(diào)。超調(diào)溫度過大同樣會(huì)對試驗(yàn)產(chǎn)生影響，所以校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要計(jì)算最大超調(diào)溫度和平均超調(diào)溫度。見圖四：MAXljl.UiU,UVE.bllUuL圖四溫度曲線超調(diào)溫度部分四、結(jié)束語聚合酶鏈反應(yīng)(PCR技

8、術(shù)由于其極高的檢測靈敏度和特異性已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、司法鑒定等工作中。有多種原因會(huì)造成PCR擴(kuò)增的錯(cuò)誤結(jié)果，排除實(shí)驗(yàn)過程中人為因素造成的誤差，PCR儀溫度控制系統(tǒng)工作性能的優(yōu)劣是造成檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差甚至錯(cuò)誤的至關(guān)重要因素。通過對PCR儀的定期校準(zhǔn)可以極大的避免PCR過程中假陽性或假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，提高PCR式驗(yàn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。參考文獻(xiàn)1王宇松，佟慧艷，張文超影響PCFR4溫度控制精度的因素分析J.生命科學(xué)儀器,2007,(02).2陳居德，楊明.PCFT增基因檢測中的溫度控制J.儀器儀表用戶,2004,(01).3張文超，劉曉光，吳勤勤.基因擴(kuò)增分析(PCR風(fēng)溫控系統(tǒng)的研究與應(yīng)用J

9、.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,(02).4陳居德，楊明.PCFT增基因檢測中的溫度控制J.儀器儀表用戶，2004,(01).5薛生虎，李東升，葉子弘，俞曉平，方榮瑞.基于多傳感器融合技術(shù)的PCFR4溫度校準(zhǔn)系統(tǒng)J.儀器儀表學(xué)報(bào)，2011,(06)IntroductiontothenecessityandmethodoftemperaturecalibrationforPCRinstrumentZhuChenbin,ZhuYichen,YaoLifang,ZhangLiping,ChenYu,ZhuXuepingAbstrat:ThesituationofusingPCRintrumentand

10、thenessityofitstemperaturecalibrationisintroducted.ThemathodofPCRinstrumentstemperaturecalibrationisgivenbythisarticle.ThetemperaturecalibrationitemsforPCRinstrumentsthatcontainthetemperatureaccuracy,temperatureuniformity,velocityoftemperaturechange,maxovershoottemperatureandmathodsofdataanalysisarealsointroducted.Soisthetemperatureanalysisof