1、    丙型肝炎病毒絲氨酸蛋白酶基因的克隆和表達        【 摘要 】目的從感染HCV的中國患者血清中擴增編碼HCV絲氨酸蛋白酶的cDNA，在大腸桿菌中進行表達。 方法從血清中提取HCV RNA，應用RT-PCR方法擴增HCV絲氨酸蛋白酶cDNA, Sanger雙脫氧鏈終止法測定其序列，與pBV220載體構建重組質粒，在大腸桿菌中表達，SDS-PAGE和Western blot分析重組蛋白。 結果用RT-PCR方法擴增得到了HCV絲氨酸蛋白酶基因，序列分析表明其讀碼框架

2、正確，絲氨酸蛋白酶活性中心高度保守，同源性比較表明該區段來源于HCV/1b中國株，構建重組載體后，在大腸桿菌中獲得了絲氨酸蛋白酶的表達。 結論HCV/1b型中國株絲氨酸蛋白酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的成功表達，為進一步研究該蛋白酶活性及影響因素打下了基礎。【 主題詞 】丙型肝炎病毒； 絲氨酸蛋白酶； 基因表達 Cloning and expression of hepatitis C virus serine protease geneFAN Tao, CHENG Jilin, LIANG Qinghua, et al.(Institute of Hepatology, Peoples Ho

3、spital, Beijing Medical University, Beijing 100044, P.R.China)【 Abstract 】ObjectiveTo amplify and clone the HCV cDNA fragment that encode serine protease from the serum of a Chinese patient infected with HCV and express it in E.coli. MethodsThe HCV RNA was extracted from serum, the cDNA that encode

4、HCV serine protease was amplified by RT-PCR. Its sequence was determined by dideoxy-chain termination method. It was subcloned into vector pBV220 and expressed in E.coli. The expressed recombinant protein was analysed by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. ResultsThe HCV serine cDNA was clone

5、d. Sequence analysis showed that its reading frame is correct and no insert or deletion mutation happened. Homology comparison suggested it is from a HCV type/1b isolate. This cDNA fragment was efficiently expressed in E.coli. ConclusionThe serine protease cDNA was amplified successfully from the se

6、rum of a Chinese patient with HCV(/1b) infection. The expression of the serine protease in E.coli rollouted a basis for the study of its activity.【 Subject words 】Hepatitis C virus; Serine protease; Gene expression HCV為單股正鏈RNA病毒，其基因組長約9.5kb，編碼區含一個大開放讀碼框架，編碼3 0103 033個氨基酸殘基的多蛋白前體，經宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物學

7、功能的成熟蛋白。研究表明，HCV非結構蛋白NS3/NS4A，NS4A/NS4B，NS4B/NS5A，NS5A/NS5B位點的裂解由病毒編碼的絲氨酸蛋白酶介導，該酶位于NS3區N端1,2。本研究中我們應用RT-PCR方法，從感染HCV的患者血清中擴增了編碼絲氨酸蛋白酶的cDNA，測定其核苷酸序列，構建表達載體，并在大腸桿菌中進行表達。材料和方法血清標本來源：HCV患者血清來自本院門診。工具酶和試劑：AMV-RT酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、Klenow大片段和限制性內切酶EcoR和Xba等均為Promega公司產品。RNasin為華美公司產品。菌種和質粒：大腸桿菌DH5為本所保存，pBV2

8、20質粒由預防醫學科學院病毒研究所張智清教授構建并惠贈。pcDNA3為Invitrogen公司產品。PCR引物設計：參考HCV-J序列3，經Oligo5.0軟件輔助設計，合成內、外兩組引物，在內引物對的5端和3端分別引入EcoR和Xba酶切位點及起始密碼子和終止密碼子。引物由CyberSyn 公司合成。引物序列為：外引物1R（4 1184 135）：GACATATACGCTCCAAAG；1F（3 3153 334）：ATCATCTCGGGTCTACCAGT；內引物2R（4 0914 106）：GACTCTAGATTAGTTTAGGACGAGCACC；2F（3 3723 387）：CAGGAAT

9、TCATGGCCGATAGTTTTGGAG。RT-PCR擴增目的基因：HCV RNA的提取參考文獻4制備好的RNA于70變性5 min，再加入逆轉錄反應液，10l反應體系中，含1×AMV-RT逆轉錄酶緩沖液，外引物1R 50pmol，dNTP終濃度各為200mol/L，AMV-RT酶0.5l，RNasin 10U，于421 h后，95 20 min。在逆轉錄產物中加入一次PCR反應液，50l反應體系中鎂離子終濃度為1.5mmol/L，dNTP終濃度各為200mol/L，Taq-P為1.5U，引物1F 50pmol。第二次PCR仍為50l反應體系，取第一次PCR產物5l，內引物2R和2

10、F各為50pmol，余同第一次PCR。PCR循環條件為94變性60 s，55退火90 s，72延伸120 s，35個循環。用6的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物。重組表達質粒的構建：先將擴增的目的基因克隆至pcDNA3質粒的EcoR/Xba之間，測定其序列，然后亞克隆至M13mp18載體，用EcoR/Sal酶切后，亞克隆至pBV220相應的位點。轉化DH5感受態細胞。用含Amp的固體培養基（LA）篩選陽性克隆，小量提取質粒，酶切鑒定，構建重組表達載體pBV220-NS3S。具體重組技術參考文獻5有關章節。核苷酸序列測定：采用Sanger雙脫氧鏈終止法，以SP6和T7通用引物進行雙向測序。目的蛋白

11、的誘導表達和鑒定：挑取含重組載體pBV220-NS3S的單個菌落置于LA液體培養基中，30培養過夜，次日加入等量預溫的培養基，42培養4 h。離心收集菌體，重懸菌體，加入等量2×SDS-PAGE緩沖液，100煮沸5 min。經SDS-PAGE后，Coomassie亮藍染色，觀察結果。Western blot鑒定：蛋白經電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉，HCV抗體陽性血清為一抗，將堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG酶標抗體為二抗，在NBT/BCIP顯色系統顯色。結果1.目的基因的擴增：經過RT-PCR擴增后，獲得的擴增產物與預期大小一致，無非特異擴增條帶。我們將該片段稱

12、為NS3S（見1）。2.序列分析：以SP6和T7通用引物對pcDNA3-NS3S中的目的基因片段進行雙向測序，結果表明，該片段為HCV基因，序列閱讀框架正確。該片段長723個堿基（不含起始密碼子和終止密碼子），翻譯成241個氨基酸。同源性分析表明屬于HCV/1b 型，與HCV型其它序列：中國河北株，HC-C2，HCV-J的同源性分別為：核苷酸95.16%，91.56%，91.15%；氨基酸95.85%，94.19%，93.78%。其核苷酸序列見2，氨基酸序列見3。1RT-PCR法擴增HCV NS3S cDNAFig 1. HCV NS3S cDNA amplification by RT-PC

13、RM: PCR marker；Lane 1: Amplified product of HCV NS3S cDNA；Lane 2: Negative control2NS3S核苷酸序列Fig 2. NS3S nucleotide sequence3NS3S氨基酸序列Fig 3.Amino acid sequence of NS3S3.表達質粒的構建和鑒定：將NS3S片段定向克隆至pBV220載體，轉化DH5細胞后，在LA固體培養基上篩選抗性克隆，挑取陽性菌落經培養，提取質粒，用EcoR/Xba酶切鑒定，電泳后可見載體片段和目的基因片段均與預期大小一致，成功構建重組載體pBV220-NS3S（見

14、4）。4.NS3S基因在E.coli中的表達：pBV220是一個含PLPR啟動子的原核高效表達載體，它同時含有cI調控基因，多酶切位點和兩個強的轉錄終止序列，帶有起始密碼子ATG的外源基因可以插入啟動子下游的多酶切位點，表達非融合蛋白6含重組載體的E.coli經溫控誘導后，SDS-PAGE染色顯示，表達了相對分子質量(Mr)約2.8×103的NS3S蛋白。Western blot結果顯示，該蛋白條帶為HCV特異蛋白。4重組載體pBV220-NS3S的鑒定Fig 4. Identification of recombinant vector pBV220-NS3SM1: DNA/Hin

15、d marker；Lane 1: pBV220 digested by EcoR；Lane 2: pBV220-NS3S digested by EcoR/Xba；M2: X174 DNA/Hae marker討論HCV基因組具有很大的變異性，這可能是由于HCV復制酶缺乏校正功能，以及宿主的免疫選擇壓力共同作用所致。對HCV的序列和型別進行分析，有助于HCV的流行病學調查，研制診斷試劑，發展預防性疫苗，并且對臨床治療有重要的指導作用7。對HCV基因序列進行分析也有助于HCV的生物學功能研究。Yamaka K等8在對HCV蛋白酶活性進行研究時發現，來自同一患者血清的多個NS3 cDNA克隆中，有

16、蛋白酶活性的克隆和無蛋白酶活性的克隆同時存在。對所有的克隆進行序列分析和比較表明，無蛋白酶活性的克隆其序列存在如下特點：(1) 氨基酸1079位無義突變，導致蛋白翻譯過程的提前終止，病毒株表現為復制缺損。(2) HDS催化中心His-1083點突變，直接導致蛋白酶活性缺失。(3) 某些位點的點突變可能與蛋白酶活性缺失有關，如Pro1168-Thr，Arg1135-Gly, 這些氨基酸似與維持NS3蛋白酶活性中心的構型有密切關系。本研究中我們應用RT-PCR方法，從HCV感染者血清中成功地擴增了HCV絲氨酸蛋白酶基因，克隆和序列分析結果顯示，該片段來源于HCV/1b株。其閱讀框架正確，無缺失或插

17、入突變，未發生無義突變。絲氨酸蛋白酶催化中心三聯體基序His-1083，Asp-1107，Ser-1165，及上述與蛋白酶活性密切相關的位點，在我們克隆的片段中均高度保守。我們將擴增的HCV絲氨酸蛋白酶基因克隆至原核表達載體pBV220，經溫控誘導后，在大腸桿菌中獲得了高效表達。由于HCV基因組在翻譯后前體蛋白的酶切加工是其基因表達的重要策略，通過酶切加工，前體蛋白裂解成有生物學活性的成熟蛋白9。因此，HCV蛋白酶與病毒基因組的復制表達，以至病毒的整個生命周期均有密切的關系。而且，HCV絲氨酸蛋白酶是抗HCV藥物作用的重要的靶點之一，對絲氨酸蛋白酶的克隆和表達，有助于研制抗HCV藥物10。我們

18、對HCV蛋白酶基因的克隆和表達為這些領域的研究打下了基礎。作者單位：范濤(北京醫科大學人民醫院肝病研究所，100044)程計林(北京醫科大學人民醫院肝病研究所，100044)梁慶華(北京醫科大學人民醫院肝病研究所，100044)陶其敏(北京醫科大學人民醫院肝病研究所，100044)參考文獻1，Major ME, Feinstone SM. The molecular virology of hepatitis. Hepatology, 1997, 25:1527-1538.2，Lin C, Pragai BM, Grakoui A, et al. Hepatitis C virus NS3 s

19、erine proteinase: trans-cleavage requirements and processing kinetics. J Virol, 1994, 68:8147-8157.3，Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, et al. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:9524-9528.4，杜紹財，陶其敏，孫焱，等. 雙PCR檢測丙型肝炎病毒RNA. 北京醫科大學學報, 1