1、江蘇1株雞傳染性貧血病毒的分離鑒定雞傳染性貧血?。–hickeninfectiousanemia,CIA）最早被稱為貧血綜合征、貧血-皮炎綜合征、出血性貧血病、貧血因子病等，其病原于1979年被首次分離并確定，早期稱其為雞貧血因子（chickenanemiaagent,CAA、雞傳染性貧血病毒（chickeninfectiousanemiavirus,CIAV）,之后逐漸統一稱作雞貧血病毒（chickenanemiavirus,CAV。CAV勺核酸為環狀單股負鏈DNA在1995年第6次國際病毒分類大會上將其與豬圓環病毒（PCV、長尾鸚鵡啄羽病病毒（PBFDV一起歸屬于圓環病毒科（Circovi

2、ridae），該科病毒是已知最小的動植物病毒，因此很少有人能通過電子顯微鏡觀察到CAV從CAVt染的MDCC-MSB1雞馬立克氏病成淋巴細胞樣細胞系）細胞培養液中純化的病毒粒子，經負染后在電子顯微鏡下呈直徑約為20nm的球狀。CAV寸乙醴、三氯甲烷均有抵抗力；對酸（pH值為3）作用3h后仍保持穩定；對56下120min、70下60min、80下15min的處理均有抵抗力。雞傳染性貧血病的特征性病理變化為骨髓黃化和胸腺萎縮。發病雞骨髓中的紅髓組織被脂肪組織替代，呈黃色；胸腺嚴重萎縮，其大小僅為正常雞的1/10。雞傳染性貧血病廣泛流行于世界各地，呈垂直和水平傳播1。1 材料1.1 待檢樣品1 日齡

3、雛雞來自江蘇省泰州市，用間接酶聯免疫吸附（ELISA）檢測其父母代種雞群血清，CAVffi性率高達87%1.2試劑和細胞exTaqDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、dNTRDL2000DNAMarker、酚氯仿異戊醇、蛋白酶K均購于大連寶生物工程XX公司；無水乙醇、三氯甲烷均購于天津市富宇精細化工XX公司；瓊脂糖購于上海英俊生物技術XX公司；EB替代物購于北京普利萊基因技術XX公司；工程菌DH5a、單克隆抗MDCC-MSB1胞、CAVS株陽性對照均由筆者所在實驗室保存與提供。細胞培養液配方為83%RPMI1640、15%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺；細胞維持液配方為93%RPMI1640

4、、5%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺；細胞凍存液配方為基礎培養液、30*40%臺牛血清、10%DMSO2 方法2.1 樣品的采集與處理于江蘇省泰州市發生雞傳染性貧血病的某雞場采集1050日齡的病雞或病死雞，在生物安全實驗室內對其進行剖檢，采集雛雞的肝、脾、胸腺等組織臟器，充分研磨后用滅菌生理鹽水制成懸濁液，加入終濃度為1000U/mL的雙抗，于37下感作60min。將其反復凍融3次后進行超聲波處理，將1000g離心4min后取上清，于70水浴處理5min，再經體積分數50%的三氯甲烷處理15min,離心并取上清，經0.22以m微孔濾膜過濾除菌后，置于-70C保存待檢。其中一份用于PCR勺初步

5、檢測，另一份用于病毒的分離培養。2.2 回歸試驗將分離毒株的第4代至第6代MSB便田胞培養物分別腹腔接種于1日齡SPF雞0.2mL/羽。于接種后14d迫殺，測定HCT值，并進行病理剖檢及病理組織學檢查。2.3 MDCC-MSB細胞培養分離將含病毒樣品接種MDCC-MSB細胞，每23d盲傳1代，每日觀察細胞病變(CPB,當70%-80%勺細胞崩解或代謝停止時收毒2，并置于-20保存備用。2.4 免疫熒光染色試驗取分離毒株細胞培養物和TK5803分別接種MDCC-MSB細胞(3.0X105個/mL),于48h后收集細胞培養物，以1000r/min離心5min,將細胞沉淀用PBS洗3次并涂于載玻片，

6、干燥后用冷丙酮固定10mino接種1日齡SPF雞的組織切片，也按同樣方法固定后作為待測抗原，進行間接免疫熒光染色，并用熒光顯微鏡觀察。2.5 分離毒株的CAV抗原檢測將1株分離毒株的細胞培養物經超聲波破碎后離心，除去細胞碎片，用PEGM縮后負染，進行電子顯微鏡觀察。2.6 樣品的PC初步檢測2.6.1 引物設計根據已發表的CAVCux-1、TR20等毒株的基因組序列設計并合成檢測引物，用于樣品的PCR僉測。擴增靶基因的理論長度為582bp,引物由北京六合華大基因科技XX公司合成。2.6.2 組織DNA勺提取采用蛋白酶K裂解法提取組織中的核酸，操作步驟如下：（1）取200以L組織研磨液移至1.5

7、mL的EP管中；（2）向EP管中依次加入300以LPBS、5以L蛋白酶K、6010%SDS,于56C水浴消化1h后，至微波爐中高火處理12min,使其透明澄清；（3）向各管加入等體積的酚氯仿異戊醇，以12000r/min離心10min；（4）將上清液移至新的1.5mLEP管中，重復步驟（3）;（5）取上清液并加入等體積三氯甲烷，以12000r/min離心10min；（6）取上清液并加入2倍體積的無水乙醇、1/10體積的NaA（c3mol/L），于室溫下靜置1h后，以12000r/min離心10min；（7）棄上清并加入500以L70%乙醇，以12000r/min離心15min;（8）棄上清，干

8、燥5min后加入40LElutionBuffer使其溶解。2.6.3PCR檢測以病毒DNA模板，用引物CAV-RCAV-F擴增所需目的基因。按反應體系（表1）配制好后混勻并置于PCRT增儀中，運彳f如下程序：95C5min;95c30s,5630s，7240s，循環35次；72延伸10min，結束后于4保存。表1PCR25反應體系組分加入體積（以L/支）10XBuffer2.5DNTP（2.5mmol/L）2.0引物CAV-R（20.0mmol/L）1.0引物CAV-F（20.0mmol/L）1.0rTaq酶0.5ddH2O15.5DNA模板（1以g/以L）2.0合計25.02.6.4PCR擴

9、增電泳操作步驟如下：（1）稱取1g瓊脂糖，與100mL的1XTAE緩沖液配成1磷脂糖溶液。（2）溶解后冷卻510min,加入14以LEB替代物并混勻。（3）架好梳子，倒入瓊脂糖溶液，靜置30min使其凝固，移去梳子。（4）將PCRT增產物與LoadingBuffer緩沖液按5：1的比例混勻，并將混勻后的液體加至電泳槽小孔中。（5）重復步驟（4），加入其他剩余PCRT增產物。（6）選用DL2000的Marker,加至電泳槽小孔中。（7）接通電源，紅色為正極、黑色為負極，將電壓調至180Vo（8）電泳條帶至1/3位置時即可停止，電泳時間約為1015min。（9）使用凝膠成像系統進行拍攝并保存。3

10、結果與分析3.1 病毒的分離鑒定感染CAV的MDCC-MSB1代細胞呈IFA陽性（圖1）。分離株CAVg電子顯微鏡觀察，與以往發現的CAV吉構一致（圖2）。分離株與CAV陽性對照的電泳條帶處于同一點位（圖3）。3.2 序列測定結果CAVMY1305-3琳基因編碼區全長為2324bp,堿基完整，無缺失和插入。與國際基因庫中可見CA»列進行同源性、親緣關系的比對分析，結果發現，具同源性為96.5%998%CAV勺3個編碼基因序列VP1（1315bp）、VP2（643bp）、VP3（366bp）均有不同程度變異，其中VP1的變異程度最大。3.3 核苷酸和氨基酸位點的改變由VP1基因比對序列

11、結果可知，MY1305-30屬于A3亞分支。在683位核甘酸中該點為T,而JAPAN-ABO46590W為G（圖4）。3.4 遺傳進化關系分析將CAVMY1305-30株基因與國際基因庫中可見CAV列進行遺傳進化比對分析，繪制遺傳進化樹。CAVMY1305-3琳VP1基因屬于以Majority為代表的基因群，與A3JAPANAB046590親緣關系最近；與CAustraliaAF227982.、CAustraliaEF683159.親緣關系最遠（圖5）。CAVMY1305-30株基因VP2序列與印度的A1IndiaAY583756CAV-B親緣關系最近，與澳大利亞的CAustraliaAF227982、CAustraliaEF683159親緣關系最遠（圖6）。4 結論與討論基因序列分析對比表明，江蘇分離株CAVMY1305-30與其他32株CAVW毒編碼區的核甘酸基因同源性為96.5%99.8%;與vp1.seq、B_JS-China_73.seq、A3JAPANAB046590.seq株相對比，VP1序列僅有1個堿基不同。單一比對VP1、VP2、VP3的生物開放閱讀框架（OR