1、    cAMP反應元件結合蛋白磷酸化與肝糖輸出調控基因表達關系的研究作者：王晶 劉曉民 李艷波 周立紅 馮曉紅 作者單位：哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院內分泌科，黑龍江 哈爾濱 150001【摘要】 目的 觀察CREB磷酸化對肝糖輸出調控基因表達的影響。方法 利用cAMP激動劑forskolin處理原代培養的大鼠肝臟細胞，以Western blot法檢測肝臟細胞處理前后CREB和磷酸化CREB蛋白的表達變化，以RTPCR方法檢測肝糖輸出調控基因PGC1、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)mRNA的表達。結果 以cAMP激

2、動劑Forskolin作用的肝細胞CREB蛋白的磷酸化水平明顯增高，肝糖輸出調控基因PGC1、PEPCK、G6Pase mRNA的表達也增高。結論 CREB磷酸化后可以調控糖異生關鍵酶的表達。【關鍵詞】 cAMP反應元件結合蛋白 磷酸化 肝糖輸出調控基因The relationship between cAMP response elements binding protein phosphorylation and glycogen output controlling geneWANG Jing, LIU XiaoMin, LI YanBo, et al.Department of End

3、ocrinology, the First Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang, China【Abstract】 Objective To observe the effect of cAMP response elements binding protein (CREB) phosphorylation on glycogen output controlling gene expressions.Methods The cultured primary liver cells of the r

4、ats were treated by cAMP agonist forskolin to detect the expressions of CREB before and after treatment and phosphorylated CREB protein by Western blot. The expressions of PGC1, PEPCK and G6Pase mRNA were determined by RTPCR. Results After treated by forskolin，the phosphorylated CREB protein level s

5、ignificantly increased, and the expressions of PGC1, PEPCK and G6Pase mRNA were obviously enhanced. Conclusions As the upstream regulatory factor of PGC1, the phosphorylated CREB could regulate the key enzymes expressions of gluconeogenesis.【Key words】 cAMP response elements binding protein (CREB);

6、Phosphorylation; Glycogen output controlling genecAMP反應元件結合蛋白(cAMPresponsive element binding protein，CREB)作為一種轉錄因子，具有廣泛而復雜的功能。研究表明，CREB是體內能源物質代謝的重要調節者,尤其在肝臟的糖代謝方面，對維持機體血糖水平的穩定發揮重要作用1，2，提示CREB可能對2型糖尿病肝糖輸出過多的發生具有重要作用。近年研究表明，糖異生途徑的兩個關鍵酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶，PGC1水平增加可激活糖異生關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖

7、6磷酸酶(G6Pase)，造成肝糖輸出的增加，在肝臟胰島素抵抗和2型糖尿病的發生發展中發揮重要作用3。CREB與以上轉錄因子和糖異生關鍵酶的關系目前還不十分明確。本研究利用cAMP激動劑forskolin處理原代培養的大鼠肝臟細胞，觀察CREB磷酸化對肝糖輸出調控基因表達的影響。1 材料與方法1.1 動物健康雄性Wistar大鼠，體重150200 g，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，動物合格證號20040001。1.2 方法1.2.1 試劑高糖DMEM培養基購自美國Hyclone公司，Forskolin購自MerckCalbiochem公司，膠原酶IV購自Sigma公司，新生牛血清購自Gi

8、bco公司，抗磷酸化CREB抗體(Ser133)、抗非磷酸化CREB抗體購自Cell signaling technology 公司。PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。表1 逆轉錄聚合酶鏈反應引物序列(略)1.2.2 大鼠原代肝臟細胞的分離和培養參照文獻4方法。大鼠腹部消毒后，10 g/L戊巴比妥鈉麻醉(2 mg/kg，ip)，開腹,分離肝門靜脈,經門靜脈插管,開放下腔靜脈,以流速10 ml/min灌流37 的前灌流液(142 mmol/L NaCl、6.7 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、pH 7.4)沖洗肝臟中的血液，再以37預熱的0.0 5

9、%IV 膠原酶灌流10 min，流速20 ml/min。當肝包膜下肝組織呈龜背狀裂隙、膠原酶灌流液充滿肝包膜下時停止，去除肝包膜，分離肝細胞，過150目篩,以DMEM清洗細胞，50 g離心5 min，3次獲取肝細胞。沉積的肝細胞用含100 ml/L小牛血清DMEM調整密度為2.5×108/L，臺盼藍染色計數細胞活率力>85%，以此密度將細胞分別接種于25 ml培養瓶和6孔板。在DMEM (10% cuff serum)、37、20%O2、5%CO2的環境下培養2.5 h后，將細胞清洗一次。之后，再在相同的培養基中培養21.5 h(合計24 h)，用得到的第一代培養肝細胞進行試驗

10、。1.2.3 藥物干預試驗原代肝臟細胞生長至對數生長期時，用含0.3%新生牛血清的DMEM培養基培養12 h，使細胞同步化，再更換無血清的DMEM培養基，以10 mmol/L(終濃度)的cAMP激動劑Forskolin作用細胞(作用1 h用于Western blot，作用4 h用于RTPCR)，同時設對照組。1.2.4 檢測指標以Western blot法檢測肝臟細胞處理前后CREB和磷酸化CREB蛋白的表達變化，以GAPDH為內參。以RTPCR方法檢測肝糖輸出調控基因PGC1、PEPCK、G6Pase mRNA的表達，具體方法參考文獻5，6。1.3 統計學分析所有數據輸入計算機，以x

11、7;s表示，運用SPSS11.0軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗。2 結 果2.1 Forskolin處理前后原代肝細胞CREB、pCREB蛋白的表達見表2。以cAMP激動劑Forskolin作用的肝細胞，與對照組相比，CREB蛋白的磷酸化水平明顯增高(P<0.01),而CREB的表達無統計學意義。表2 Forskolin處理前后原代肝細胞CREB、pCREB蛋白的表達(略)2.2 Forskolin處理前后原代肝細胞PGC1、PEPCK和G6Pase mRNA的表達見表3。以cAMP激動劑Forskolin作用的肝細胞，與對照組相比，肝糖輸出調控基因PGC1、PEPCK、G6Pas

12、e mRNA的表達也增高，差別均有統計學意義(P<0.01)。表3 處理前后原代肝細胞PGC1、PEPCK和G6Pase mRNA的表達(略)3 討 論磷酸化與脫磷酸化是調節CREB活性的重要機制之一，目前研究最多的是PKA，在PKA介導下，通過CREB在Ser133位點的磷酸化形成磷酸化CREB和磷酸化ATF1(activating transcription factor 1)，cAMP調節一系列基因的表達。近幾年的研究顯示，空腹狀態下CREB通過抑制PPAR和誘導PGC1(PPAR Gamma Coactivator)而調節肝臟糖脂代謝7。糖異生的速率主要靠某些糖異生途徑單向酶(關

13、鍵酶)的激活來控制，如PEPCK、果糖1,6雙磷酸酶及G6Pase，編碼這些蛋白的基因在轉錄水平上被一些關鍵激素控制，特別是胰島素、胰高血糖素和糖皮質激素。無論是在1型糖尿病還是2型糖尿病，肝糖輸出過多是空腹高血糖和餐后高血糖的重要原因8。Herzig等1研究揭示了空腹狀態下CREB激活生糖基因的兩步模式：空腹早期，針對兒茶酚胺和胰升糖素的刺激，CREB Ser133磷酸化，通過CREB介導的直接效應而誘導某些生糖基因(如PEPCK)的表達;若繼續空腹，CREB通過誘導肝臟PGC1的表達進一步強化生糖基因(PEPCK、丙酮酸羧化酶和G6Pase)的表達，隨后PGC1對糖皮質激素信號做出反應，介

14、導糖異生過程的激活。本研究中根據文獻9及預實驗，加入cAMP激動劑Forskolin作用于原代培養的大鼠肝臟細胞，可使CREB的磷酸化水平明顯增高，而且PGC1、PEPCK和G6Pase mRNA的表達也明顯高于對照組，可見CREB是PGC1的上游調節因子，其正常的生理作用對維持機體血糖穩定具有重要意義，提示磷酸化CREBPGC1糖異生關鍵酶這一反應鏈在2型糖尿病的病理生理改變中發揮一定的作用，阻斷它們之間作用的小分子化合物有可能作為降低2型糖尿病空腹血糖的有效輔助治療手段。【參考文獻】1 Herzig S，Long F，Jhala US,et al.CREB regulates Hepati

15、c Gluconeogenesis via the Coactivator PGC1J.Nature,2001;413:17983.2 Herzig S，Hedrick S，Morantte L,et al.CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPARgammaJ.Nature，2003;426:1903.3 Handschin C，Spiegelman BM.Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator 1 co

16、activators，energy homeostasis，and metabolismJ. Endocr Rev，2006;27(7):72835.4 趙 媚,肖 琳,楊 琳，等.丙戊酸鈉對培養大鼠肝細胞的毒性作用J.第四軍醫大學學報，2005;26(3)：22931.5 Oetjen E，Lechleiter A，Blume R，et al.Inhibition of membrane depolarisationinduced transcriptional activity of cyclic AMP response element binding protein (CREB) by the dualleucinezipperbearing kinase in a pancreatic islet beta cell lineJ.Diabetologia，2006;49(2):33242.6 趙文惠，蕭建中，楊文英，等.肝臟胰島素抵抗與肝糖輸出調控基因表達的關系J.中華肝臟病雜志，2006;14：457.7 Gonzalez GA,Yamamoto KK,Fischer WH,et al.A cluster of