1、植物體POD的測定<原理>了解過氧化氫酶活性測定的幾種方法，掌握用愈創木酚法分別測定過氧化氫酶和過氧化物酶的活性。過氧化物酶廣泛頒布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創木酚氧化，生成茶褐色物質，可用分光光度計測量生成物的含量。<實驗材料、試劑與儀器設備>1、實驗儀器722型分光光度計、離心機、秒表、電子天平、研缽2、實驗試劑愈創木酚、30%過氧化氫、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、反應混合液100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50mL，加入愈創木酚28uL，加熱攪拌，直至愈創木酚溶解，待溶液冷卻后

2、，加入30%過氧化氫19uL，混合均勻保存于冰箱中3、實驗材料任何植物材料<實驗步驟>1、粗酶液的提取稱取植物(小麥葉片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研缽中研磨成勻漿，以10000r/min離心10分鐘，收集上清液保存在冷處，所得殘渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并兩次上清液。2、酶活性的測定取比色皿2只，于一只中加入反應混合液3mL，KH2PO41mL，作為校零對照，另一只中加入反應混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性過高可適當稀釋)，立即開啟秒表，于分光光度計470nm波長下測量OD值，每隔30s讀數一次。以每分鐘表示酶活性

3、大小，即以OD470/min.mg蛋白質表示，蛋白質含量測定按Folin法進行。<結果計算>以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.g(鮮重)表示之。也可以用每min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(u)表示。 過氧化物酶活性u/(g.min)=式中：A470反應時間內吸光度的變化。 W植物鮮重，g。 VT 提取酶液總體積，mL。Vs 測定時取用酶液體積 ,mL。 t反應時間，min。 項目詳細信息介紹項目名稱 過氧化物酶(POD)活性的測定（比色法）所屬實驗課程植物生理學實驗學年度2007-2008學期01專業分類生物化學關鍵詞過氧化物酶(POD)

4、活性的測定實驗要求選修帶課教師陳穎實驗目的過氧化物酶廣泛分布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創木酚氧化，生成茶褐色物質，可用分光度計測量生成物的含量。基本描述1稱取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸緩沖 (pH7.0) 10ml(分三次加入，最后兩次用于洗研缽)，在研缽中研磨成勻漿，以 4 000rmin 離心15分鐘，傾出上清液。 2取一試管加 3.8 ml 0.3%愈創木酚反應液，加100ul 3過氧化氫，加酶液100ul （視酶活性大小而定，如酶濃度高可稀釋后再測定），搖勻，立即在分光光度計470nm下測吸光度，從加入酶液時立即開啟秒表記錄時間，1分鐘時

5、讀數一次（也可2min，視材料而定）。 3以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白質（或鮮重g）表示之。過氧化物酶活性(U)=A470/min×稀釋倍數/g.Fw 該實驗涉及到的主要儀器設備null實驗總人數30每組人數4實驗學時2是否特色否實驗地點植物生理學實驗室3.POD的測定方法試劑配制：（1）0.1mol/L的醋酸緩沖液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸緩沖液 A(0.2mmol/L的HAc溶液)6ml冰醋酸溶到494ml蒸餾水中 B(0.2mmol/L的NaAc溶液)13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈創木酚溶液

6、125um愈創木酚溶于50ml 50%乙醇中（臨用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（臨用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸緩沖液1ml 0.25%愈創木酚溶液xml酶液（5min值為500-800即可）0.1ml 0.75%H2O2溶液迅速巔到混勻把A460調零并開始計時1次/30s,連續讀取3min過氧化物酶(POD)活性的測定【實驗原理】植物體內的黃素氧化酶類代謝產物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的積累可導致破壞性的氧化作用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(PO

7、D)是清除H202的重要保護酶，能將H202分解為02和H20,從而使機體免受H202的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關。(CAT)催化如下反應：2 H2022 H20+ 02本實驗通過測定H202的減少量來測定CAT的活性。在H202存在條件下，過氧化物酶能使愈創木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚。可用分光光度計測生成物的含量來測定活性。【試劑藥品1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml3.0.2% 愈創木酚 :秤0.2g愈創木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml【實驗步驟】酶液的制備1.稱取葉片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min離心15min取部分上清液經適當稀釋后用于酶活性測定。2. CAT活性的測定在3ml的反應體系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液啟動反應，測定波長240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。3. POD活性的測定在3ml的反應體系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈創木酚0.95ml,pH7.