1、用熒光分光光度法測定中藥配用熒光分光光度法測定中藥配方顆粒對自由基的清除作用方顆粒對自由基的清除作用 答辯人：張承答辯人：張承導師：蔡繼文教授導師：蔡繼文教授選題意義選題意義1. 自由基是一種外層軌道上含有未配對電子自由基是一種外層軌道上含有未配對電子的原子、原子團或呈特殊狀態的分子。的原子、原子團或呈特殊狀態的分子。2. 機體內自由基大量產生或清除過緩機體內自由基大量產生或清除過緩,使積累使積累超過臨界水平后超過臨界水平后, 就會對機體產生損傷，就會對機體產生損傷，各種炎癥、癌癥、臟器損傷、老化等都與各種炎癥、癌癥、臟器損傷、老化等都與自由基密切相關自由基密切相關 。( (一一) ) 自由基

2、概述及其危害自由基概述及其危害( (二二) ) 中藥以及中藥配方顆粒中藥以及中藥配方顆粒 中藥抗氧化劑具有經濟和毒、副作用小等中藥抗氧化劑具有經濟和毒、副作用小等明顯的優點明顯的優點, , 在中草藥中在中草藥中, , 有許多藥物都對自有許多藥物都對自由基有清除作用。由基有清除作用。 中藥配方顆粒品質優良，效果客中藥配方顆粒品質優良，效果客觀，使用簡便快捷，必將成為觀，使用簡便快捷，必將成為2121世紀中醫藥配世紀中醫藥配方的主流。因此研究它的藥性有著重要的意義。方的主流。因此研究它的藥性有著重要的意義。( (三三) ) 測定自由基清除率的方法測定自由基清除率的方法 電子自旋共振法、高效液相色譜

3、法、化學發光法、紫外分光光度法、熒光分光光度法等。 本實驗采用用儀器簡單，操作方便的熒光分光光度法對中藥消除自由基的性能進行研究。1.1.實驗原理實驗原理 Fe2+Fe2+EDTAEDTA在弱堿性介質中可還原在弱堿性介質中可還原溶解氧產生溶解氧產生 OHOH，其進攻對苯二甲酸產生，其進攻對苯二甲酸產生強熒光羥基化產物強熒光羥基化產物2 2羥基對苯二甲酸羥基對苯二甲酸(HOTP) . OH(HOTP) . OH清除劑加入后清除劑加入后, , 導致導致HOTP HOTP 的的生成量減少生成量減少, ,從而體系熒光強度明顯降低。從而體系熒光強度明顯降低。實驗內容實驗內容2. 儀器儀器 日本日本 島津

4、島津RF-5301PC熒光分光光度計，激發波熒光分光光度計，激發波長長316 nm，測定發射光譜，測定發射光譜 。 3. 試劑及反應體系試劑及反應體系 對苯二甲酸鈉溶液對苯二甲酸鈉溶液(1. 0 10- 4 mol/ L); Fe2 + ( 硫酸亞鐵溶液硫酸亞鐵溶液,1. 0 10- 3 mol/ L)； EDTA(1. 0 10- 3 mol/ L)；磷酸鈉緩沖溶液；磷酸鈉緩沖溶液(0. 2 mol/ L ;pH =7. 4) , 山茱萸等中藥配方顆山茱萸等中藥配方顆粒。粒。 依次加入對苯二甲酸溶液依次加入對苯二甲酸溶液0.50 mL, EDTA 溶溶液液0. 3 mL, 中藥顆粒溶液中藥顆

5、粒溶液0.5mL；Fe2 + 溶液溶液0.30 mL, 緩沖液緩沖液2.00 mL ,稀釋至稀釋至10.0 mL ,反應反應6 min后測定體系熒光強度。后測定體系熒光強度。4.4.實驗內容及其結果討論實驗內容及其結果討論(1).(1).不加中藥時體系的發射光譜不加中藥時體系的發射光譜123 由此可見由此可見, ,羥基對苯二甲酸是體系的唯一的強熒光物質，羥基對苯二甲酸是體系的唯一的強熒光物質，自由基或者是對苯二甲酸本身不產生熒光。峰值位置為自由基或者是對苯二甲酸本身不產生熒光。峰值位置為426nm 426nm 1:對苯二甲酸對苯二甲酸+Fe2+EDTA 2:與與1相比相比,無對苯二甲酸鈉無對苯

6、二甲酸鈉 3:與與1相比相比,體系中沒有加入體系中沒有加入Fe2+(2)(2)測定中藥自身的發射光譜，激發波長測定中藥自身的發射光譜，激發波長316nm 316nm 為減小誤差，選擇了在為減小誤差，選擇了在426nm處的熒處的熒光強度值相對較小的中藥光強度值相對較小的中藥: 半支蓮，山茱萸，茶多酚，黃芩，半支蓮，山茱萸，茶多酚，黃芩，紅花，桂枝，地龍，柴胡，豬苓紅花，桂枝，地龍，柴胡，豬苓(3)(3)對各種中藥進行抑制自由基的測定對各種中藥進行抑制自由基的測定無中藥 熒光強度F0 中藥名中藥名C=C= 0.03g/L中藥自身熒中藥自身熒光強度光強度F 加入中藥后加入中藥后熒光強度熒光強度F 清

7、除率（）清除率（）F0-(F- F)/F)/F0 0 黃芩黃芩63.803154.98474.1紅花紅花109.52241.01662.6桂枝桂枝83.272211.28463.6地龍地龍88.537233.33858.8柴胡柴胡87.727231.92359.0豬苓豬苓59.979217.03555.3各種中藥對自由基的清除率各種中藥對自由基的清除率(4)用不同濃度的半支蓮，山茱萸和茶多酚進行研究用不同濃度的半支蓮，山茱萸和茶多酚進行研究 無中藥半支蓮對自由基的抑制作用半支蓮對自由基的抑制作用山茱萸對自由基的抑制作用山茱萸對自由基的抑制作用 無中藥茶多酚對自由基的抑制作用。茶多酚對自由基的抑

8、制作用。 無中藥（5).5).山茱萸和半支蓮不同比例的混合物對自由基的山茱萸和半支蓮不同比例的混合物對自由基的 抑制作用抑制作用 熒光強度值沒有明顯的提高或降低，沒有發現熒光強度值沒有明顯的提高或降低，沒有發現有明顯的協同或負協同效應。有明顯的協同或負協同效應。空白茶多酚茶多酚 半支蓮半支蓮 山茱萸山茱萸 濃度濃度/g/l F 清除清除率率/% 濃度濃度/g/l F 清除清除率率/% 濃度濃度/g/l F 清除清除率率/% 0.10189.573.60.10120.346.70.10200.577.90.08175.4 68.10.08131.251.00.06189.973.80.06159

9、.1 61.80.06118.946.20.04170.466.20.04143.7 55.80.04129.950.50.02141.354.90.02126.2 49.00.01103.540.20.0193.3236.20.008113.644.10.00886.833.70006100.039.00.00685.933.40.00497.437.80.00480.431.20.00288.434.40.00273.528.5不同濃度的中藥及其清除率不同濃度的中藥及其清除率5. 數據處理數據處理0.020.040.060.080.100.450.500.550.600.650.700.7

10、5c/g/L清除率0.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.340.360.380.400.420.44清除率c/g/L0.0020.0040.0060.0080.0100.280.290.300.310.320.330.340.350.360.37清除率c/g/L茶多酚半支蓮山茱萸斜率 3.07相 關 系 數0.999斜率 15.3相關系數 0.974斜率 8.94相關系數0.978用對苯二甲酸羥基化反應體系可以評價中藥用對苯二甲酸羥基化反應體系可以評價中藥清除清除 OH OH 的作用能力。可以粗略的得到一的作用能力。可以粗略的得到一定濃度下各種中藥的清除率。定濃度下各種中藥的清除率。可以看出在一定的濃度范圍內，中藥顆粒濃可以看出在一定的濃度范圍內，中藥顆粒濃度與其清除率大致成線性比例。度與其清除率大致成線性比例。在較高濃度范圍山茱萸的清除自由基能力好在較高濃度范圍山茱萸的清除自由基能力好于半支蓮，而在低濃度時相反。于半支蓮，而在低濃度時相反。三三 實驗結論實驗結論創新點創新點 當前對中藥的提取物的清除自由基研究已當前對中藥的提取物的清除自由基研究已經比較多。而對使用的越來越廣泛的中藥配方經比較多。而對使用