1、    血清HIV抗體陰性靜脈藥癮者肝組織HIV DNA測定吳南屏劉克洲陳智李繼承R.H.Dennin 【摘要】目的了解血清抗-HIV陰性的靜脈藥癮者肝組織是否存在前病毒HIV DNA。方法 選擇38例抗-HIV陰性的靜脈藥癮者肝組織，10例非靜脈藥癮者肝組織，用巢式聚合酶鏈反應，分別在HIV gag、pol、env三大結構區，用六對引物進行HIV DNA擴增。結果38例中有3例同時在三個區域測到HIV DNA，12例分別在二個區域、17例在單一區域檢測到HIV DNA，6例在HIV三個區域均陰性。對照組10例無一例檢到HIV DNA。結論抗-HIV陰性

2、的靜脈藥癮高危人群，存在潛在HIV感染。提示潛在HIV感染的檢測及加強"窗口期"HIV的監測十分重要。 【關鍵詞】靜脈藥癮抗-HIV人類免疫缺陷病毒DNA Detection of HIV DNA by nPCR in liver tissue of anti-HIV seronegative intravenous drug usersWu Nanping,Liu Kezhou,Chen Zhi,et al.Institute of Infectious Diseases,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003 【Abstr

3、act】ObjectiveThe study was designed to investigate whether there existed provirus HIV DNA in the liver tissues of intravenous drug users (IVDU) with seronegative results of anti-HIV test.MethodsWe detected 38 liver tissues of seronegative IVDUS and 10 liver tissues of non-IVDUS.Using different prime

4、rs in HIV gag,env as well as pol regions respectively,HIV DNA was detected by nPCR.ResultsIn all 38 cases,3 simultaneously reacted to all three HIV regions (HIV,gag,env,pol),12 reacted to two HIV regions,17 reacted to single HIV region and 6 cases did not react to any HIV region.No sample of control

5、 group was found reacting to any HIV region.ConclusionIt showed that there might exist HIV infection is some of HIV seronegative IVDUS at high risk of HIV infection.So it is very important to detect potential infection and prevent "windows" HIV infection. 【Key words】Intravenous drug usersA

6、nti-HIVHIV DNA 從HIV感染到機體產生抗-HIV，其"窗口期"時間長短直接與HIV感染的量、毒力、感染方式及人體遺傳、免疫狀況有關。國外報道已在血清HIV抗體陰性的靜脈藥癮者中找到特異的HIV DNA，其陽性率高達23%80%16，但作者尚未見組織中找到HIV DNA的報道。我們對38例抗-HIV陰性靜脈藥癮者肝組織，用六對引物分別在HIV LTR-gag、pol、env區進行HIV核酸擴增，以了解高危人群HIV抗體陰性者HIV感染情況及探討可能的HIV免疫逃逸機制。 材料與方法 一、標本來源 38例標本均來自德國，為血清抗-HIV陰性的靜脈用藥過量死亡者的肝

7、組織。無菌條件下取肝組織，迅速深低溫-70保存備用。死亡前作為HIV高危人群，ELISA(德國Mercke公司)測定為抗-HIV陰性。10例對照組標本系抗-HIV陰性的因交通事故經外科手術切除的部分肝組織標本。 二、肝組織DNA抽提 取400mg新鮮凍存肝組織，低溫下磨碎(勻漿器事先用三蒸水處理18030分鐘干烤消毒，并一次使用后丟棄)加500l預冷的2×lysis(Tris-HCl 0.02mmol/L,NaCl0.3mmol/LEDTA0.02mol/L, 2% SDS pH7.8)及終濃度為500g/ml的蛋白酶K。混勻55保溫3小時，9510分鐘滅活蛋白酶K。加等量酚：氯仿(

8、11)3 500r/min離心15分鐘，重復2次后，用等量氯仿，3 500r/min離心15分鐘。取上清用2倍量的100%乙醇和1/10體積的3mol/L醋酸鈉沉淀DNA，-20過夜，次日13 000r/min離心15分鐘，沉淀用70%乙醇洗滌，室溫干燥，用80l TE(Tris-HCl0.01mol/L EDTA 0.001mol/L)溶解DNA，4備用。為防止交叉污染，所有工作均在不同的無菌超凈臺進行，抽提過程均使用一次性無菌器皿。 三、寡核苷酸引物的選擇 HIV特異的引物按已發表的序列由德國呂貝克大學微生物研究所合成，六對引物分別位于HIV LTR-gag、pol、env區，所有標本均用

9、套式PCR對HIV不同區域逐一擴增。HIV LTR-gag外套引物為M667/SKO3C(449-956)，內套引物為M661/SKO1C(675-920)，HIV pol外套引物pol 104/pol 4(2394-3117)，內套引物pol 3/pol 312k(2810-3017)，HIV env外套引物env 526/env co2(7800-7989)，內套引物env col/571k(7855-7942)其擴增片段分別為HIV LTR-gag 245bp,pol 208bp,env 88bp。 四、聚合酶鏈反應(PCR) PCR條件HIV LTR-gag,pol,env不同引物及標

10、本分別在滅菌的Eppendorf管中進行，各管反應總體積為100l，內含10l 10×PCR buffer(MgCl2 0.025mol/L、KCl 0.05mol/L,Tris-HCl 0.01mol/L pH9.2)8l dNTP每種200Umol/L,1l 1%凝膠，引物20pmol、模板DNA 10l DNA聚合酶3U。所有試劑及酶均由德國Mercke公司提供,加DH2O總量至100l。PCR擴增程序為95 1.5分鐘后，94 1.5分鐘，56 1.5分鐘，72 1.5分鐘共35個循環，72延伸5分鐘。擴增內套用相同程序，所不同的是取5l第一次擴增產物作二次擴增。模板二次擴增

11、產物在2%的瓊脂糖凝膠電泳(0.5g/ml EB)觀察結果。 表1肝組織HIV DNA測定總結果 組別 套式PCR* 各組別HIV特異區域nPCR擴增結果 +(%)-(%) LTR-gag env pol +(%) -(%) +(%) -(%) +(%) -(%) 實驗組 32 6 30 8 10 28 10 28 (84.2) (15.8) (78.9) (21.1) (26.3) (73.7) 26.3 (73.7) 對照組 0 10 0 10 0 10 0 10 (100) (0) (100) (0) (100) (0) (100) * HIV各區域只要有一個區域nPCR為陽性，即作為陽

12、性結果統計；HIV各區域均陰性作為陰性結果統計 結果 一、肝組織HIV DNA測定結果 見表1，使用不同區域HIV的六對引物，用套式PCR分別檢測HIV DNA特異基因。從表1我們可以看到38例肝組織中有30個在HIV LTR-gag區對引物M667/sk03c M661/sk01c發生特異擴增。10個標本(26.3%)對HIV env區引物env 526/CO2、env COl/571k發生特異性擴增。10例標本(26.3%)對HIV-pol引物pol 104/pol4、pol3/321k發生特異性擴增。 二、HIV特異區域nPCR分類結果 見表2。可發現38例中有3個同時在HIV LTR-

13、gag、pol、env三個區域產生特異性條帶，12例分別對HIV LTR-gag和pol區或HIV LTR-gag、env區產生特異性條帶，17個單一LTR-gag或pol、env產生特異性條帶。6例標本在HIVLTR-gag、pol、env均不產生特異性條帶。對照組10例在HIV各個區域均未發現陽性結果。 表2各HIV特異區域nPCR分類結果 標本編號 nPCR結果 標本編號 nPCR結果 LTR-gag env pol LTR-gag env pol 1 + + + 20 - - - 2 + - + 21 + - - 3 + - + 22 + - - 4 - - + 23 + - - 5

14、+ - + 24 - - - 6 + - + 25 + + - 7 + - - 26 + - - 8 + + + 27 - - - 9 + + - 28 + - - 10 + - - 29 + + - 11 + + - 30 + - - 12 + - - 31 + + - 13 + + + 32 + - + 14 - - - 33 - - - 15 - - - 34 + - - 16 - - + 35 + - - 17 + - - 36 + - - 18 + + - 37 + - - 19 + + - 38 + - - 討論 研究HIV靜止"窗口感染期"是非常重要的。此期如

15、感染了HIV而未被檢出，感染者可作為潛在傳染源在機體免疫功能低下時，病毒擴增而引起HIV的傳播。本試驗從38例靜脈藥癮過量死亡者肝組織中抽提DNA，用套式PCR及6對特異HIV引物分別在HIV LTR-gag、pol、env擴增HIV DNA。結果發現32/38例(84.2%)靜脈藥癮者肝組織標本中可測到特異的HIV DNA，其中3例標本在HIV LTR-gag、pol、env同時測到HIV DNA特異序列，12例標本同時在2個區域HIV LTR-gag、pol或HIV LTR-gag、env區測到HIV DNA，17個單一區域測到HIV DNA。6例標本在HIV LTR-gag、pol、en

16、v三個區域全部陰性。已知HIV血清轉換期可達1842個月4，個別可達63個月7，此期HIV感染，病毒可持續潛伏或宿主產生免疫耐受。因此用PCR檢測低水平HIV前病毒DNA感染十分必要。有關靜脈藥癮者感染HIV，但血清抗體陰性，國外報道可能與下列因素有關。HIV感染到抗體陽轉，一般在6周左右，但國外報道靜脈藥癮者其窗口期可達6個月以上6，8，這可能是HIV感染量少、病毒潛伏或整合在一些敏感細胞內如外周的單個核細胞內，暫時不被激活，而逃逸了機體免疫監視。也可能是靜脈藥癮者年輕，機體免疫功能好而抑制了病毒表達。其次，靜脈藥癮者可能有不同平常的血清轉化期，其它HIV病毒亞型的感染或同時感染其他病毒，使

17、其持續處于窗口靜止期。Farzadegan等9報道同性戀者可以有一些高選擇HIV亞型感染，以致使其HIV抗體持續陰性，而造成傳播。選擇肝組織作研究是因為肝內大量存在枯否細胞，它是一類單核細胞系，是HIV感染的敏感細胞，加之肝血流量大，極易感染；其二，抗-HIV陰性而淋巴細胞內已感染HIV已有報道69，而組織整合HIV未見報道；其三，肝組織來源豐富易保存。本試驗著重做整合HIV RNA，故選擇肝組織。關于PCR污染問題，Sabion等10報道可存在0.5%1%操作污染，在我們的研究中已事先考慮了這個問題，在整個操作過程中除均使用一次性器皿外均設對照組，并且在不同實驗室重復實驗，結果令人滿意。對照

18、組為非靜脈藥癮者無一例陽性。 用套式PCR證實存在HIV DNA特異序列，說明靜脈藥癮血清HIV抗體陰性并不意味沒有受HIV感染，相當一部分人已感染了HIV并可作為潛在傳染源而威脅他人。關于靜脈藥癮者血清抗體陰性持續時間的長短，它們之間HIV RNA和HIV DNA之間的關系及是否感染HIV亞型或合并其他病毒感染將作進一步研究報道。 本課題受國家自然科學基金資助(39780036) 作者單位：310003杭州，浙江醫科大學傳染病研究所(吳 南屏、劉克洲、陳智、李繼承)；德國呂貝克醫科大學(R.H.Dennin) 參考文獻 1Schnittman SM,Greenhouse JJ,Psallid

19、opoulos MC,et al.Increasing viral burden in CD4+T cells from patients with HIV infection reflects rapidly progressive immunosuppression and clinical disease.Ann Intern Med,1990,113:438-443. 2Imagawa DT,Lee MH,Wolinksy SM,et al.Human immunodificiency virus type-1 infection in homosexual men who remai

20、n seronegative for prolonged period.N EngL Med,1989,320:1458-1462. 3Sorlano V,Hewlett I,Tor J,et al.Silent HIV infection in heterosexual partners of seropositive drug abusers in spain.Lancet,1990,335:860-864. 4Hewlett LK,Gregg RA,Ou CY,et al.Detection in plasma of HIV-1 specific DNA and RNA by polym

21、erase chain reaction before and after seroconversion.J Clin Immunoassay,1988,11:161-164. 5Beretta A,Stanley H,Weiss F,et al.Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-seronegative injection drug users at risk for HIV exposure have antibodies to HLA class I antigens and T cells specific for HIV envelope.J Infect Dis,1996,173:472-476. 6Markham D,Yiaofang Yu,Farzadegen H,et al.Immunodeficiency virus type 1 env and p17gag seronegative injection drug users.J Infec Dis,1995,171:797-804. 7Nelson KE,Vlahov D,Mr