1、實驗室練習 6 :數據定量分析積分69Agilent TechnologiesInnovating the HP Way實驗室練習6:數據定量分析在這個實驗中，您將建立具有三個濃度級別的校正數據庫方法的一部分。該方法用于未知物的定量計算。在這個實驗中：-獲取所需信息以設置校正方法*建立一個 5 個濃度級別的含內標的校正數據庫*定量一個未知化合物對以下化合物進行定量：,并將其保存為實驗室練習 6 :數據定量分析積分70內標目標化合物Tributyl phosphateAcetamide,N-phe nylphe naceti ncaffe in實驗室練習 6 :數據定量分析積分71積分精確定量的

2、重要因素之一是正確積分1)通過選擇 File/LoadDataFile 調用 C:MSDCHEM1DATAVOADATACLWV020.D 文件，選擇 Method / Load Method 調用 DEFAULT.M 方法。2)選擇 Chromatogram / Select Integrator 及 RTE Integrator 單擊 OK。OK 對積分來說只是臨時選擇?，F在讓我們對 caffein 設定積分參數。3)選擇 Chromatogram / Extract Ion Chromatograms 完成圖 1 所示 的需要輸入的項目(注意時間范圍)單擊 0K。Use mass ran

3、ge from - 0.30to i- 0 JOamuOKCancelHelp圖14) 現在編輯 RTE 的缺省積分參數。選擇 Chromatogram / MS SignalIntegration Parameters 完成圖 2 所示的要輸入的項目。須知當欲在最小峰面積(minimum peak area)中添入大于 100 的數之前 必 須選中 Area Counts 選項框。實驗室練習 6 :數據定量分析積分x72RTE Integidbor ParametersNOTICE5)單擊 OK 接受所做的改變。 現在通過選擇 Chromatogram / Integrate用這些參數做 積

4、分。注意離子 194 被積分，而離子 67 沒 有被積分。讓我們降低最小面積來解決這一問題。6)選擇 Chromatogram / MS Signal Integration Parameters 完成圖 3 中所示的各項內容。Baseline reset (It points) BaseIine PreferenceIf leading or trailing edge enzEnE513.10CBro modichloro methaneG15.9301,1,2-Tilcihlort etti an e* before Compnuind Name denotes ISTDViewInse

5、rt AboveDeleteExitHelp圖916）單擊 View 鍵查看三頁定量信息。在第 3 頁對錯誤的值進行編輯17） Next 鍵用來查看第二個化合物的條目。單擊 0K 離開該畫面，而單 擊Exit 退出 Edit Compounds 面板回到數據分析。現在我們擁有了含一個級別的校正數據庫。下一步是為校正數據庫添加 第二個濃度級別。圖 8實驗室練習 6 :數據定量分析建立多-濃度級別校正數據庫79建立多-濃度級別校正數據庫1） 調用數據文件 C:MSDCHEM1DATAVOADATACLWV050.D. 。2） 選擇 Calibrate / Update / Update One L

6、evel / O!統將提示該數 據文件未定量，單擊 Yes 進行定量。3） 下一步進入 Update Calibration 對話框。將濃度改為 50,將校正級別 改為2,單擊 Do Update自動為數據庫插入新濃度級別。4） Exit 退出 edit compounds 界面。從這一標準校正曲線更換保留時間和離子比例，會改寫原來用光標輸入 的和這一標準的微小差別。5） 選擇 Calibrate / Update / Update One Level / O!寫圖 10 所示 各項內容，單擊 Do Update。圖 106）按照 1）至 5）步驟輸入下列濃度級別。不必再次輸入保留時間和離 子

7、比例。數據文件和化合物濃度列于表 2 中：數據文件濃度濃度級別號CLWV100.D100ppm3CLWV150.D150ppm4CLWV200.D200ppm5表 2內標濃度與前兩個標樣相同（50 ppm）。7)5 個濃度級別輸入之后，單擊 View 以便檢查濃度是否正確。8)選擇第一個化合物，單擊 Plot 看它的標準曲線，包括其校正因子和 相關系數。出現什么信息？實驗室練習 6 :數據定量分析建立多-濃度級別校正數據庫80由于畫內標化合物的曲線是無意義的，您不可能畫出內標化合物的校正 曲線，為什么內標化合物曲線是無意義的？9)在 Compound 窗口單擊 Next (如必要擊 0K 保存

8、更改)畫面，化合物#2 以校驗該化合物的第二個濃度級別的數據。在Plot 窗口單擊Print 打印(這是獲得方法文件的較好途徑)。10) 打印之后擊 0K，改變線性擬合方式取得最佳平均響應因子(Avg ofRespo nse Factors)再做曲線。反復用 Lin ear Regr， Force (0,0)擬合 包括原點在內的各點，加以比較。重新設置擬合方式Avg ofResp onse Factors對本次分析何種擬合方式更可靠，為什么？11) 查看過三頁化合物信息之后，選 OK 然后 Exit 退出該窗口。該校正數據庫當前存儲在計算機 RAM 中，所以下一步是使其永久保存 于硬盤中。校正

9、數據庫作為方法的一部分保存。12) 選擇 Method / Save Method。13) 為新方法命名為 CLASSVOA.M。建立了新方法，原來的方法(DEFAULT.M)未改變。我們常用現有的方 法作為模板建立新方法。方法自動存儲在缺省地址C:MSDCHEMnMETHODS 這里 n 是儀器編號。使用自動定量設置建立多-濃度級別校正數據庫81使用自動定量設置AutoQuant Setup （自動定量設置）提供了一種給定量數據庫創建化合物 列表的半自動方法。下列指南可引導您使用 AutoQua nt Setup （自動定 量設置）的全部步驟。該指南使用化學工作站隨附的演示文件。在該指南中使

10、用 default.m 和 evaldemo.d 之前，請先復制一份。1.在 Data Analysis （數據分析）中，加載示范方法C:MSDCHEM1METHODSDEFAUL 和示范數據文件C:MSDCHEM1DATAEVALDEMO.D2. 在 Spectrum / Select Library （譜圖/選擇譜庫）下選擇 DEMO.L使用自動定量設置建立多-濃度級別校正數據庫823.選擇 Calibrate / AutoQuant Setu4. 出現 Quantitation Database Globals（全局定量數據庫）對話框時，進行如下更改：校準標題一鍵入 AutoQuant

11、Tutorial使用 RTEINT 選中該對話框來使用 RTE 積分器（不選則使用化學工作站積分器）。單擊 0K （確定）。5. 出現 Dodecane （十二烷）的 Choose Compound Name（選擇化合 物名稱）對話框時，單擊 Skip （跳過）。為了示范，您可以先跳 過這個化合物，以后再把它添加到數據庫中。6. 接下來出現 Biphenyl （聯苯）。保持缺省名稱，單擊Add （添加）。7. 接著出現 4-Chlorobiphenyl（4-氯聯苯）。保持缺省名稱，單擊Add （添加）。8. 接著出現 Methyl palmitate（十六酸甲酯）。要將它指定為內標，單擊 IS

12、TD （內標）。單擊 ISTD 同時把化合物添加到數據庫 中。9. 當軟件提示 Quantitate now?（現在定量？）時，單擊 Yes（是）。文件量化后，出現 Update Calibration（更新校準）對話框。10. 選擇 Add New Level （添加新校準級），輸入如下內容：Calib Level ID = 50Cmpd Co nc= 50ISTD Cone = 50然后單擊 Do Update （執行更新）。11. 顯示 Edit Compounds （編輯化合物）對話框時，注意十六酸甲酯 處于列表頂端的正確位置，在其名稱旁邊有一個星號說明它是內 標。12. 單擊 Exi

13、t （退出）關閉對話框，或單擊 View （查看）檢查第 1 頁、第 2頁和第 3 頁中的各化合物參數。13. 要了解怎樣向定量數據庫中插入化合物，請選擇AutoQuantSetup （自動定量設置）。14. 選擇 Insert Compounds in Database（在數據庫中插入化合物），單擊 0K （確定）。（校準/自動定量設置）使用自動定量設置建立多-濃度級別校正數據庫8315. 出現 Quantitation Database Globals（全局定量數據庫）對話框時，不要更改參數。單擊 0K （確定）。軟件會再次開始鑒定 峰。出現 Choose Compou nd Name（選

14、擇化合物名稱）對話框。16. 對話框中出現 Dodecan （十二烷）時，保持缺省名稱并單擊Add（添加）。出現 Edit Compound （編輯化合物）對話框。17. 選中 Biphenyl （聯苯），選擇一個插入點并單擊Insert Above（插入上文）。18. Choose Compou nd Names（選擇化合物名稱）對話框中留存的 3個化合物已經存在定量數據庫中，因此單擊Skip （跳過）。跳過這 3 個化合物后，軟件將問您是否 Stop Now?（現在停止?）單 擊 Yes（是）。這一特點在對大量化合物進行數據庫操作時非常 有用。19. 系統問您是否希望定量數據庫時，單擊Ye

15、s（是）。20. 出現 Update Calibration（更新校準）對話框時，選擇Recalibrate （重新校準）并對 Responses （響應）和 Retention Times（保留時間）字段選擇 替換。單擊 Do Update （進行更 新）。21. 出現 Edit Compounds （編輯化合物）對話框時，單擊 View （查 看）并檢查數據庫中 4 個化合物中每個化合物的第 3 頁。注意 您加入的Dodecane （十二烷）沒有濃度值。22. 在 Concentratio （濃度）字段對校準級 50 鍵入 50。單擊 OK（確定），然后單擊 Yes （是）保存更改后的數據

16、。23. 單擊 Exit （退出）。使用自動定量設置未知化合物定量84未知化合物定量1)調用 C:MSDCHEM1DATAVOADATADLWV002.D. 選擇Quantitate / Calculate。哪個窗口用來顯示報告結果？2)在 Quantitate 菜單條目下選 Generate Report 同時指定格式為Detailed，輸出終端為 Printer。3)單擊 0K。該報告與摘要報告有何不同？當校正數據庫中有大量被測物，而僅僅對其中之一感興趣時使用詳細報 告(單一化合物)。4)選擇 Quantitate / Report Options 填寫下圖所需要的內容，擊 OK。使用自動

17、定量設置未知化合物定量855)在 Quantitate 菜單下選 Generate Report.同時指定格式為Detailed，輸出終端為 Printer。6)單擊 0K。該報告與以前的詳細報告有何不同?圖 11使用自動定量設置未知化合物定量867) 選擇 Quantitate / Report Options 按圖 12 完成面板，單擊 0K。使用自動定量設置未知化合物定量87Quantitalion Aepoit OptionsGraphics For Chromatogram(s) flPagesYAxis ScaleP Peak Labeling帀Landscape Orterita

18、tiori兩Global Minimum Detection LimitSummary Report Onl)f* Quantitation Ion廠Scan NumberDetailed Report Only(* Scan-Stle ReportSIM Sle RepatOmit Graphic Reports for廠InternalStandards? Sv$tem Monitofing/Surrogate$Minimum Detection Limit0.00Apply Sample Multiplier ToInclude Non T arget Peak$Internal StandardsNoticeP System Monitoring Compourids/S urrogaleI nclude Seco