1、昆明種小鼠與C57BL/6J小鼠磷酸二酯酶亞單位編碼基因pde6b序列特點的比較分析         11-01-31 14:05:00     編輯：studa20                作者：閆果林, 吳有盛, 郭群, 安晶, 劉新平, 張作明【摘要】  目的: 分段克隆昆明種小鼠磷酸二酯酶(PDE) 亞單

2、位編碼基因pde6b CDS序列全長, 分析比較昆明種小鼠與C57BL/6J小鼠PDE 亞單位編碼基因pde6b序列的差異。方法: 設計覆蓋pde6b CDS區的引物序列, 通過逆轉錄聚合酶鏈式反應擴增并克隆入載體pMD18T中, 轉化大腸桿菌,酶切鑒定后測序。通過生物信息檢索、 序列拼接并應用生物信息學相關軟件進行序列分析。結果: 克隆了野生型昆明種小鼠的pde6b CDS全長。昆明種小鼠與C57BL/6J小鼠pde6b CDS區(NM_008806)相比較存在如下不同: 昆明種小鼠第706位堿基為A, 而數據庫中序列NM_008806為G; 第1149位堿基前者為T, 后者為C。昆明種小鼠

3、與C57BL/6J小鼠pde6b編碼的蛋白序列差異并不明顯, 僅有第236位氨基酸殘基為甘氨酸（G）突變成絲氨酸（S）, 為相對保守性替換關系。結論: 克隆了昆明種小鼠pde6b CDS 區全長序列; pde6b基因在不同種屬小鼠之間編碼序列存在差異, 表現出多樣性特點, 但蛋白序列保守性較高。 【關鍵詞】  視網膜色素變性 磷酸二酯酶 pde6b 多態性Abstract  AIM: To clone and sequence the phosphodiesterase 6 subunit (pde6b) gene of Kunming mice, and to compa

4、re it with counterpart sequences in the GenBank database. METHODS: The primers were designed covering the CDS region of the pde6b gene, and the corresponding fragments were amplified using RTPCR. The fragments were cloned into plasmids, amplified in E.coli, and sequenced. Bioinformatics programs and

5、 online tools were used to analyze the sequences. RESULTS: The CDS of the pde6b gene of Kunming mice was cloned and sequenced. Compared with the inbred mice C57BL/6J, pde6b CDS sequence of Kunming mice was different in some points: a GA transition at +706, a CT transversion at +1149. The protein seq

6、uence was of little difference: only a glycineserine at +236. CONCLUSION: The pde6b CDS region of Kunming mice was successfully cloned. Pde6b sequences are of some level difference in different kinds of mice, but they are most conserved in protein level.Keywordsretinitis pigmentosa; phosphodiesteras

7、e; pde6b; polymorphorism磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）在光傳導過程中發揮著重要作用, 外界光子的刺激使視紫紅質（rhodopsin）活化, 后者激活光轉導素（transducin）, 活化的轉導素又激活了視桿細胞中的PDE, PDE降解感光細胞內環磷酸鳥苷（cGMP）使其濃度降低。cGMP 是光感受器離子通道的特異性受體, 它的降解導致視桿細胞膜陽離子通道關閉, Na+、 Ca2+內流減少, 光感細胞超極化, 從而引起視覺沖動向視覺中樞逐級傳遞, 人們因此而感受到光線的刺激1, 2。現在已經發現, PDE的異常在很多視網膜色素變性疾病患者中廣

8、泛存在3, 4。視桿細胞PDE由、 和2個亞基組成, 其中、 為活性亞基, 與抑制性亞基分離后可以單獨或者協同發揮生理功能。pde6b基因編碼由856個氨基酸殘基組成的PDE 亞單位, 它的突變常常引起PDE功能異常, 光傳導鏈被切斷, 并最終導致光感受器細胞的凋亡5。視網膜退行性變（retinal degeneration, rd1）小鼠是被人們廣泛研究的一種視網膜色素變性小鼠模型, 致病基因被確定為pde6b6, 其exon7上一個無義突變是導致疾病發生的原因7。在實驗中發現一種視網膜退行性變小鼠（昆明種來源）, 遂將其與野生型昆明種小鼠交配而建立了家系。目前已經確定其遺傳方式為常染色體隱

9、性遺傳, 其視網膜病變表現出發病早、 進展快的特點8, 與文獻報道的rd1小鼠很相似, 推測其可能也與pde6b基因的異常有關。由于公共數據庫中缺乏昆明種小鼠的序列信息, 為了分析視網膜色素變性小鼠的pde6b基因的異常, 設計引物擴增pde6b CDS并測序。1  材料和方法1.1  材料  野生型昆明種小鼠（16只, 8周左右, 體質量2025 g, 雌雄各半）購自第四軍醫大學動物實驗中心; TRIzol試劑、 dATP為Invitrogen公司產品; rTaq DNA聚合酶（TaqTM）、 dNTPs、 Pyrobest DNA聚合酶、 EcoR、 Hind

10、內切酶、 T4 DNA連接酶、 pMD18T 載體購自TaKaRa公司, AMV逆轉錄酶、 Oligo(dT)15 引物為Promega公司產品;  凝膠回收試劑盒、質粒微量提取試劑盒為Ugene公司產品。1.2  方法1.2.1  引物設計  根據NCBI核酸數據庫中NM_008806.1序列設計擴增pde6b CDS序列的引物pde6b_、 、 、 、 、 和pde6b_(表1), 參照文獻9應用序列特異性引物聚合酶鏈反應（polymerase chain reacionsequence specific primer, SSPPCR）方法擴增昆明小

11、鼠pde6b基因相應片段。表1  擴增pde6b CDS序列的引物pde6b_、 、 、 、 、 和pde6b_的引物序列（略）Tab 1  Primers for amplifying fragments of the pde6b gene1.2.2  視網膜總RNA的提取  頸脫臼法處死16只昆明種小鼠, 無菌剪刀取眼球, 1×PBS漂洗, 顯微鏡下剪去眼前節,   將眼后節放入液氮速凍。1.2.3  RTPCR  取眼后節組織約50 g(單只小鼠雙眼球, 16組)用TRIzol試劑提取視網膜總RNA

12、, 適量DEPC水溶解。2 g total RNA分別以Oligo（dT）15 Primer和基因特異性引物pde6b_ asp為引物用AMV RT反轉錄酶反轉錄cDNA。Oligo（dT） 15 Primer反轉錄體系為: 2.0 g總RNA, Oligo（dT）15 Primer 1.0 g, 10 mmol/L4×dNTPs 2.5 L, 總體積10 L; Gene Specific Primer pde6b_ asp反轉錄體系為: 2.0 g總RNA, 10 mol/L pde6b_ asp 3.5 L, 10 mmol/L4×dNTPs 2.5 L, 總體積10

13、L。70變性10 min, 立即置冰上5 min, 加入AMV RT后置熱循環儀上42反應60 min。PCR反應體系為10×PCR buffer 2.5 L, 2.5   mmol/L dNTPs 2.0 L, 10 mol/L Sp/Asp 1.0 L, cDNA模板1.0 L, 5 U/L Pyrobest DNApol 1.0 L, ddH2O 17 L。循環參數設置如下: 預變性95, 5 min, 變性95, 30 s, 退火5354, 40 s, 延伸72, 40 s, 40個循環, 72, 7 min。pde6b_、 pde6b_、 pde6b_退

14、火溫度為53, pde6b_、 pde6b_退火溫度為54, pde6b_、 pde6b_ 采用Touchdown PCR方法擴增, 循環條件為: 預變性95, 5 min, 變性95, 30 s, 退火660.530 S 55, 延伸72, 40 s, 40個循環, 72, 7 min。1.2.4  克隆載體的構建及序列測定  擴增產物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳分離, 紫外燈下切取目標片段, 用Ugene H.Q.Q.凝膠回收試劑盒進行膠回收。采用如下體系進行加A反應: 40 L膠回收產物, 10×PCR buffer 5 L, 2.5 mmol/L dAT

15、Ps 5 L, 5 U/L rTaq 1.0 L。反應完成后膠回收目的片段, 以10 L體系連接, 16過夜。取過夜連接產物按照常規方法轉化感受態細胞XL10。37孵箱中培養16 h后可見明顯菌落生成, 挑取單克隆菌落37以200 r/min震蕩培養過夜。無菌超凈臺中收取細菌, Ugene H.Q.Q.質粒微量提取試劑盒提取質粒, EcoR、 Hind內切酶雙酶切鑒定。將每個片段鑒定正確的至少3個克隆送公司測序。1.2.5  序列分析  對于每只小鼠RTPCR擴增的各片段測序結果, 首先在NCBI上利用VecSreen程序查找并去除測序報告中的載體序列, 然后通過BLASTTn檢索相關序列, 再將測序得到相同片段的采用CLUSTAL W (1.83)程序進行多序列比對, 對于不一致的個別堿基以2條序列相同者為正確, 提取出一條準確