1、    急性髓系白血病中16號染色體倒位分子病因學研究          近年來,借助于細胞遺傳學和分子生物學技術肯定了染色體異常在腫瘤發生機制中的作用。16號染色體倒位inv(16)約占急性髓系白血病(AML)的15%，現認為它是AML的亞型中急性粒-單核細胞白血病伴嗜酸粒細胞增多癥(M4EO)的特征性的異常核型，且提示較好的預后。隨著研究的深入，已明確倒位的結果是長臂的MYH11基因與短臂的CBF基因發生融合，產生一融合基因，并在幾乎所有攜帶inv(16)的白血

2、病患者體內檢測到融合基因轉錄本，該融合基因可能在白血病的發生機制中起重要作用。我們將近年來各國學者對inv(16)在AML-M4EO中的分子病因學的研究作一綜述。1982年Arthur和Bloomfield1首次報道了inv(16),當時描述為del(16)(q22)。他們所研究的病例臨床診斷為急性非淋巴細胞白血病伴骨髓中嗜酸粒細胞增多，其中3例為M2，2例為M4。同年,在第四屆國際白血病染色體會議上將此類患者歸為亞型M4。在以后的幾年里,其他研究者陸續證實了該亞型的存在,并發現大多數患者攜有inv(16),僅少數有del(16),亦有t(16；16)2。1985年FAB分型作了修改,將那些在

3、骨髓中出現一定比例的嗜酸粒細胞的M4定為M4EO,其染色體異常有inv(16),del(16)(q22)和t(16；16)。1993年Liu等證實inv(16)的分子結果是16號染色體長臂的CBF基因與短臂的MYH11基因融合產生一融合基因。CBF基因編碼的蛋白質是一稱為CBF或PEBP2的DNA-蛋白質復合體的亞單位。MYH11基因編碼肌球蛋白重鏈平滑肌型(a smooth muscle form of myosin heavy chain)。CBF蛋白的靶DNA序列是許多在造血干細胞中特異表達的基因的啟動子或增強子區域,所以CBF基因是由髓系細胞轉化而引起的白血病的極為關鍵的“轉換”基因3

4、,4。1M4EO的臨床特點伴有inv(16)的白血病臨床診斷多為“M4EO”，亦可見于其它類型，如M2、M5、骨髓增生異常綜合征(MDS)和慢性粒細胞白血病(CML)急變，少見于M1、M6、M7及急性淋巴細胞白血病(ALL)。AML-M4EO的臨床特點：骨髓中粒細胞和單核細胞浸潤，外周血單核細胞計數增高,骨髓和外周血中均可見嗜酸粒細胞,約占非紅系細胞的5%30%,且有其獨特的形態和細胞化學特性。AML中已知的幾組染色體重排,包括t(8；21)(q22；q22),t(15；17)(q22；q11)和inv(16)(p13；q22)都提示有較好的預后。研究表明,inv(16)的患者對化療較敏感,易

5、獲得完全緩解,且可維持緩解5。2細胞學特點嗜酸粒細胞有特征性的染色和細胞遺傳學特點,如特征性的嗜酸性顆粒,并夾雜有不成熟的嗜堿性顆粒,氯乙酸酯酶和Schiff試劑有陽性反應。目前仍不清楚是來自于白血病細胞群體還是繼發性反應性增多。Adriaansen對M4EO伴inv(16)的病例進行了廣泛的表面標記物的檢測,表明它在細胞群的分布具有異質性。幾乎所有細胞都攜帶CD13髓系細胞的特異標志；大多細胞CD34或CD14陽性,在某些CD34和CD14雙陽性的細胞中有T細胞的標志物CD2的存在,CD2的表達與細胞的增殖能力有關6。以上的研究提示,M4EO中的白血病細胞有著與眾不同的分化途徑,即同時具有T

6、系和髓系細胞標記的表達。有意義的是許多T細胞特異的基因都含有可為CBF識別的啟動子或增強子區域。3分子生物學特點Dauwerse、Callen、Liu等相繼用粘粒、YAC探針，運用FISH等技術將16號染色體長、短臂的斷裂點分別定位于16p13.11-13.3,16q223,4,7,8。Claxton等9運用逆轉錄-聚合酶鏈反應方法在幾乎所有伴inv(16)的白血病患者體內檢測到CBF-MYH11融合基因的轉錄本,并在融合部位設計了寡核苷酸引物,用Southern印跡法加以證實。CBF基因位于長臂q22,長50kb,含6個外顯子,其結構在果蠅中高度保守,編碼與鼠轉錄因子CBF(PEBP2B)同

7、源的結構域。mRNA水平分析,斷裂點較恒定(nt495,nt399),常在外顯子5和6之間的內含子,還可見于3端相距外顯子531bp的位點,結果在外顯子6造成不同閱讀框架,產生不同的剪接轉錄本,90%為短型(182個氨基酸),保留了轉錄本的閱讀框架；少見的為長型(187個氨基酸),不符合閱讀框架。而MYH11基因位于短臂p13,斷裂點變異較多,78%在nt1921,其他nt1708,nt1201,nt1098,nt99410。CBF是一主要表達于T細胞的蛋白質,可結合鼠白血病病毒(MLV)增強子的保守核心區域,其DNA順序為PyGPyGGTPy。CBF蛋白由二個亞單位組成：亞單位可結合靶DNA

8、順序,亞單位并不直接與DNA結合,而是通過與亞單位形成異二聚體來增加DNA-蛋白復合體的穩定性11。迄今已闡明的三種不同的亞單位皆保留一稱為Runt的結構域,后者可結合DNA并能與亞單位發生相互作用。其中2由AML1基因編碼,后者多在t(8；21)和t(3；21)易位中受累12。亞單位目前已知的僅一種,它并不含有任何已明確的DNA結合基序或轉錄激活功能域,也未發現與其它基因和蛋白質有任何的相似。但由于CBF所有編碼區域在inv(16)中全部保留,故推測融合蛋白仍能與亞單位形成異二聚體,亞單位也因此介導了白血病的發生。SMMHC基因(MYH基因)是肌球蛋白家族的一員,其典型的結構：具有ATP酶活

9、性的頭部,可結合肌動蛋白和主機械運動；鉸鏈區；長尾區,由成串具螺旋-螺旋特點的結構域排列而成,有利肌絲的組裝。目前的研究表明,斷裂點位于尾部區域,故inv(16)的結果是其尾部的羧基末端與CBF融合形成inv(16)蛋白,后者仍能使CBF與相應DNA核心區域結合成DNA-蛋白復合體,與野生型CBF相比,它對含有核心區域基因的調控可能有兩種不同的效應：“顯性正”作用,增強野生型的功能；可能通過阻抑亞單位的“顯性負”作用。Liu等13構建了包含全長CBF-MYH11和野生型CBF的cDNA的質粒運用于生化和遺傳學研究,并根據現有的試驗數據提出三種模式試解釋inv(16)蛋白的功能。3.1“顯性超活

10、化”(Dominant Superactivation)模型：inv(16)蛋白與野生型CBF功能相同,只是以高度活化的形式。如inv(16)可能更有效地穩定CBF與DNA的結合。另外,肌球蛋白的尾部自身也具潛在的反式激活功能域。但體內結合和轉染試驗不支持該假說。3.2“顯性負”(Dominant Negative)模型：通過體內翻譯試驗,inv(16)蛋白在EMSA(electophoretic mobility shift assay)中呈現極慢的遷移率,據推測是通過肌球蛋白尾部形成高分子量結構,后者可阻斷相當量的CBF，使之無法結合到靶DNA順序。但在MMLV增強子的核心區域的突變解除了

11、inv(16)的抑制作用,提示inv(16)蛋白不是簡單地阻斷CBF，而是以序列特異的方式活躍地抑制啟動子的轉錄。3.3“干擾”(Interference)模型：亞單位和inv(16)蛋白形成的復合體可能改變位于特定靶基因增強子鄰近部位序列特異的轉錄因子的裝配。MYH11長尾部干擾這些轉錄因子與靶DNA順序結合。但是產生活化還是抑制效應則取決于受累轉錄因子的性質,即其結合區域的構象。盡管第三種模式更合理,但目前仍不能完全肯定,尚需進一步的研究來明確inv(16)蛋白在細胞中的定位,它與其它蛋白的相互作用及對靶基因的影響。綜上所述,inv(16)是與AML-M4EO密切相關的異常核型,該染色體上

12、的兩個基因融合產生了融合基因。隨著對其研究的不斷深入,它在AML發病機制中的重要作用將日益明了,這無疑對臨床診斷、殘留白血病的檢測、預后判斷還是將來治療策略的構想方面皆具有重大的意義。參 考 文 獻1Bloomfield CD,Arthur DC.Del(16)(q21 or q22) and marrow eosinophilia in acute nonlymphocytic leukemia(ANLL)：a new cytogenetic-clinical association.Proc Am Soc Clin Oncol,1982(abstr),38:191.2Le Beau MM,

13、 Larson RA,Bitter MA, et al. Association of an inversion of chromosome 16 with abnormal marrow eosinophils in acute myelomonocytic leukemia.N Engl J Med,1983,309:630-636.3Liu P,Claxton DF,Marlton P,et al.Identification of yeast artificial chromosomes containing the inversion 16 p-arm breakpoint asso

14、ciated with acut myelomonocytic leukemia.Blood,1993,82:716-721.4Liu P,Tarle SA,Claxton DF,et al.Fusion between transcription factor CBFPEBP2 and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia.Science,1993,261:1041-1044.5Larson RA,Williams SF,Le Beau MM,et al.Acute myelomonocytic leukemia with abnorm

15、al eosinophilias and inv(16) or t(16；16) has a favorable prognosis.Blood,1986,68:1242-1249.6Adriaansen HJ,te Boekhorst PAW,Hagemeijer AM,et al.Acute myeloid leukemia M4 with bone marrow eosinophilia(M4EO) and inv(16)(p13；q22) exhibits a specific immunophenotype with CD2 expression.Blood,1993,81:3043

16、-3051.7Dauwerse JG,Kievits T, Beverstock GC,et al.Rapid detection of chromosome 16 inversion in acute nonlymphocytic leukemia,subtype M4 regional localization of the breakpoint in 16p.Cytogenet Cell Genet,1990,53:126-128.8Callen DF,Kuss B,Willman CL,et al.Precise localization of the long arm breakpo

17、int of the inv(16) of ANLL M4EOand progress towards cloning this breakpoint.Am J Hum Genet,1992(abstr),51:A57.9Claxton DF,Liu P,Hsu HB,et al.Detection of fusion transcripts generated by the inversion 16 chromosome in acute myeloid leukemia.Blood,1994,83:1750-1756.10Hebert J,Cayuela JM,Daniel MT, et

18、al.Detection of minimal residual disease in acute myelomonocytic leukemia with abnormal marrow eosinophils by nested polymerase chain reaction with allele specific amplification.Blood,1994,84:2291-2296.11Ogawa E,Inuzuka M,Maruyama M,et al.Molecular cloning and characterization of PEBP2，the heterodimeric partner of a novel Drosophila runt-related DNA binding protein PEBP2.Virology,1993,194:314-331.12Meyers S,Downing JR,Hiebert SW,et al.Identification of AML-1 and the(8；21) translocation protein(AML-1/ETO) as sequence-specifi