1、多孔雙相鈣磷陶瓷在脊柱后路融合中成骨作用和降解特性的組織學觀察（附20例活檢分析）【摘要】目的了解多孔雙相鈣磷陶瓷在人體脊柱后路融合中的成骨變化及降解過程。方法對20例脊柱后路融合的雙相鈣磷陶瓷活檢標本行不脫鈣硬組織切片檢查。觀察陶瓷周圍和內部的新生組織、陶瓷的形態改變、降解顆粒及伴隨的細胞吞噬反應。其中14例標本行組織形態計量，根據患者的年齡、植入時間及臨床結果分組比較成骨及材料降解的速度。結果所有的雙相鈣磷陶瓷標本均可見新生骨組織，與自體骨接觸越多，陶瓷內的新生骨組織越多。絕大部分陶瓷內可見降解顆粒，部分顆粒位于巨噬細胞內。不同標本的新生骨和材料降解速度差異較大。陶瓷內的新生骨隨植入時間的

2、增加而增多，但隨患者年齡的增大而減少。陶瓷的降解率隨患者年齡的增大而減少，但不受植入時間的影響。后路融合成功組的活檢標本的新生骨量高于融合失敗組，但材料降解率則反之。結論多孔雙相鈣磷陶瓷是一種骨傳導材料，但植入體內降解緩慢，不能被新生骨組織完全替代。植入時必須將陶瓷與自體骨充分混合以獲得良好的骨長入。陶瓷產生的降解顆粒及誘發的細胞吞噬反應必須引起注意。 【關鍵詞】 脊柱后路融合； 雙相鈣磷陶瓷； 骨形成； 生物降解 Tissue reactions of porous biphasic calcium phosphate ceramic in posterior spinal fusionXI

3、E Youzhuan, ZHU Zhenan, ZHANG Pu，et al. Department of Orthopaedic Surgery, the 9th Peoples Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China Abstract：ObjectiveTo reveal the osteogenesis, the biodegradation and tissue reactions of the porous biphasic calcium phosphate

4、ceramic (PBC) in human spine.MethodThe histological study was carried out on 20 PBC samples retrieved from posterior spinal fusion. All the PBC samples were treated by undecalcified histological preparation. The tissue in or around the material, the change of ceramic shape,the particles and the pres

5、ence of macrophages were observed. The quantitative study was performed in 14 samples with sufficient size. The residual material and the newly formed bone were analyzed according to the patient age，the duration in vivo and clinical results.ResultNewly formed bone was found in all the samples. More

6、new bone was formed in those samples closely in contact with autogenous bone. The PBC degradation particles were present both in the macrophages and around the tissue. But those phenomena were highly variant among the samples. New bone formation increased with time and decreased with the age. The ma

7、terial degradation decreased with the age, but it did not differ greatly with time. New bone formation was higher and the residual material was lower in the fusion group than in the nonfusion group.ConclusionThe PBC is a kind of osteoconductive material and does not transform into new bone after a r

8、elatively long time. The PBC should be well mixed with the autogenous bone in order to achieve high new bone colonization. The PBC degradation particles and related active phagocytotic activity have been noted. Key words：posterial spinal fusion; calcium phosphate ceramic; osteogenesis; biodegradatio

9、n 退行性椎間盤病變、脊柱不穩和脊柱側彎等疾病的手術治療常需進行脊柱后路融合。自體骨移植是促進融合的金標準方法，但自體骨供區并發癥的發生率可高達24%。此外，自體骨的取骨量有限，不能滿足日益增加的翻修手術需求。盡管融合時也可采用同種異體骨，但免疫排斥反應及潛在傳播傳染性疾病的可能又使其應用受到一定的限制。近年來，人工合成的多孔雙相鈣磷陶瓷日益受到重視并應用于臨床,且在動物1和人體2的脊柱后路融合中取得了良好的效果。然而，大多數臨床研究主要以影像學改變和臨床癥狀、體征的改善為評判標準，組織學活檢觀察甚少。大多數組織學觀察來源于動物實驗研究，但由于物種的差異，低等脊椎動物的實驗結果不能完全代表人體

10、的生物學改變。由于組織學觀察能最直觀地了解這些材料在人體內的生物學變化，因此，本研究對20例脊柱后路融合手術的多孔雙相鈣磷陶瓷活檢標本進行組織學觀察，以較真實地了解其在人體的生物學改變。 1 材料與方法 1.1 病例資料 19932002年法國Calot醫院共收集20例多孔雙相鈣磷陶瓷活檢標本，均取自脊柱后路融合的患者。其中男2例，女18例；年齡1170歲（平均45.2歲）。原發性診斷包括先天性脊柱側凸畸形（1例），特發性脊柱側凸畸形（11例），退變性脊柱側凸畸形（7例），腰椎不穩（1例）。最大融合范圍從T1至骶骨。每例融合手術均使用內固定器械固定，雙相鈣磷陶瓷和自體骨混合植骨。活檢時間為術后

11、256個月（平均24個月）。所有活檢均在患者行第次脊柱后路手術時進行?；颊呓邮艽问中g的原因包括內固定器械拆除（6例）、融合失?。?例）、融合區臨近節段椎間盤突出（3例）、腰椎不穩（2例）、重置內固定（1例）。活檢標本來源于腰段（15例）、胸腰段（1例）、胸段（1例），有3例標本取自的節段未詳細記載。 1.2 植入材料 本組患者中，17例應用條狀雙相鈣磷陶瓷（5 mm5 mm20 mm），3例應用顆粒狀陶瓷（直徑13 mm）。該陶瓷由磷酸三鈣（40%）和羥基磷灰石（60%）組成，孔徑為300600 m，孔隙率約為50%10%。脊柱后路融合采用混合植骨，即雙相鈣磷陶瓷與局部去皮質骨粒（16例）或自

12、體髂骨（2例）混合移植。2例自體骨來源記載不明。 1.3 組織形態學觀察及計量 所有標本在取材后立即用10%中性福爾馬林濃液固定，14 d后用梯度乙醇濃液脫水，甲苯透明后用甲基丙烯酸甲酯包埋。應用Leica鋸式切片機切片，切片初始厚度約為200 m，研磨至約50 m厚，拋光后用苦味酸-品紅溶液染色。 每個標本觀察2張連續切片。觀察指標有：雙相鈣磷陶瓷周圍和內部的新生組織；陶瓷形態的改變；顆粒及伴隨的細胞反應。本組標本中，6例因體積過小，無法進行定量研究，僅進行形態學觀察；其余14例標本較大，且均為條狀陶瓷，進行組織形態計量學測量。測量的指標主要有： (1)新骨形成率（VPB）=陶瓷內部形成的新

13、骨面積/陶瓷孔的總面積； (2)材料殘余率（VRM）=殘存的陶瓷面積/植入陶瓷的總面積； (3)新骨占孔率（NbB）=形成新骨的孔數/總的孔數； (4)材料周邊的骨接觸率（PIB）=與骨接觸的材料周長/材料的總周長。 1.4 統計學處理 所有結果用均數表示。植入時間與新骨形成率（VPB）、新骨占孔率（NbB）之間的關系采用Spearman秩相關分析，同法分析材料周邊的骨接觸率（PIB）和新骨形成率（VPB）、新骨占孔率（NbB）之間的關系。 2 結 果 所有的雙相陶瓷標本均可見新骨形成，但不同病例的新骨形成率差異較大。11例陶瓷標本內可見大量的新骨形成(圖1a)，9例標本僅在陶瓷周圍的孔內形成

14、新骨(圖1b)。與自體骨緊密接觸的陶瓷中形成的新骨較多。僅形成少量或未形成新骨的陶瓷孔內可見纖維組織形成。從整體上看，雙相鈣磷陶瓷的骨架結構變化不大，孔連接徑大小很不均一。陶瓷周圍和內部可見降解顆粒，其中19例標本觀察到數量不等的材料降解顆粒，顆粒周圍可伴隨活躍的多核巨細胞，細胞內可見吞噬的降解顆粒(圖2a，2b)。一些降解顆粒和吞噬細胞位于材料的表面，但在形成新骨的陶瓷表面，未見降解顆粒。 14個標本行組織形態學計量測量，植入時間為243個月，新生骨組織為33%（VPB）或38%（NbB）。陶瓷周邊的骨接觸率為19%。材料殘余率為52%，與植入前變化不大。 根據患者年齡將14例陶瓷標本分為3

15、組：少年組（50歲）5例。結果表明材料的殘余率隨年齡增大而增多，新生骨隨年齡組增大而減少。新骨形成率最大的病例出現在少年組內，達81.8%(圖3)；新骨形成率最小的病例出現在青中年組內，僅0.6%。 根據陶瓷植入體內的時間分3組：1年內3例，12年5例，2年以上6例。結果發現材料內新生的骨組織隨植入時間的延長而增多，材料殘余率隨植入時間變化不大。 根據最終是否融合成功分為2組：融合成功組9例，融合失敗組5例。結果顯示融合成功組新骨形成率（VPM，37%；NbM, 41%）明顯大于融合失敗組（VPM，24%；NbM, 33%）。材料的殘余率則融合成功組（51%）低于融合失敗組（53%），即融合成

16、功組的材料降解較快。 相關分析研究發現植入時間與新骨形成率VPB（r=0.05, P=0.86）、新骨占孔率NbB(r=0.14, P=0.62)無顯著相關，但材料周邊的骨接觸率PIB與新骨形成率VPB（r=0.84, P0.01）、新骨占孔率NbB(r=0.81, P0.01)呈顯著相關。 3 討 論 應用多孔雙相鈣磷陶瓷促進脊柱后路融合已取得較好的臨床效果。雙相鈣磷陶瓷由磷酸三鈣和羥基磷灰石組成，具有與骨基質相同的化學成份，多孔結構有助于骨髓基質干細胞移行、貼附、增殖和分化為成骨細胞，可作為骨傳導性支架促進骨長入，因此本研究中的所有陶瓷均形成不同數量的新骨。但不同病例的新生骨量的差異較大，

17、這是由于脊柱的融合過程還受到如患者年齡、植入材料、植入部位的機械環境及植骨床的準備情況等因素的影響。 圖1a 雙相陶瓷的周圍孔及中心孔均可見新骨形成，陶瓷周圍與自體骨(星號)緊密接觸。（苦味酸品紅染色，3.125） 圖1b 雙相陶瓷的周圍孔形成少量類骨質（箭頭）和礦化骨（星號），中心孔見纖維組織形成，無新骨。注意陶瓷周圍無自體骨。（苦味酸品紅染色，3.125） 圖2a 雙相陶瓷的孔內可見新骨形成，周圍有大量的降解顆粒。（苦味酸品紅染色，50） 圖2b 高倍視野下可見陶瓷降解顆粒位于多核巨細胞內或細胞外。（苦味酸品紅染色，100） 圖3 來源于19歲患者的雙相鈣磷陶瓷標本，可見大量新骨（類骨質：

18、黃綠色；礦化骨：紅色）形成，陶瓷表面覆蓋新生骨，未見降解顆粒。（苦味酸品紅染色,25） 從材料結構上分析，雙相鈣磷陶瓷的孔與孔連接的不均一可引起本研究中不同病例間新生骨量的差異。研究表明孔徑為300 600 m的陶瓷適于骨組織長入3，孔連接徑為30 m的陶瓷比60 m的陶瓷形成的纖維組織多，孔連接徑大于50 m能確保礦化骨的形成3。本組材料具有良好的孔徑（300600 m），但孔連接徑大小很不不均一，而導致新生骨量的差異。此外，羥基磷灰石在體內難以降解，而磷酸三鈣植入體內周后就開始降解，因此，當雙相鈣磷陶瓷的磷酸三鈣成分開始降解后，羥基磷灰石仍未降解，材料的大體骨架仍然存在，材料的孔與孔連接也

19、不會發生顯著改變。本組鈣磷陶瓷植入后殘余材料的孔隙率與植入前變化不大，表明材料本身的結構未發生明顯的改變或材料未降解。有些陶瓷植入體內長達4年余，但仍未能降解消失或轉化成骨組織，因此，雙相鈣磷陶瓷僅是一種骨傳導性支架，而非骨替代物，雙相鈣磷陶瓷不會被新骨完全替代4。近年研究表明引入干細胞或誘導因子能促進其成骨5。 本研究發現陶瓷內新生骨量隨年齡增加而減少，隨植入時間的延長而增加；一少年患者植入雙相鈣磷陶瓷38個月后，陶瓷活檢標本顯示其新生骨量最大，達81.8%。這一結果表明雙相陶瓷的成骨量受患者的年齡和植入時間的影響：青少年的成骨活動較活躍，新生骨量也較大。此外，陶瓷內成骨量還與融合技術有關。

20、近年研究表明雙相陶瓷必須與自體骨（如局部去皮質骨粒）混合植入，與自體骨緊密接觸的陶瓷的新生骨明顯增多1。本研究發現未接觸自體骨的雙相鈣磷陶瓷成骨量較低(0.6%22%)，相關分析表明植入鈣磷陶瓷與自體骨接觸越緊密、越多，陶瓷內部形成的新骨越多，與文獻報道一致，這是因為植骨床、植骨塊或去皮質骨粒在新骨長入的過程中起重要的作用。去皮質良好的植骨床及局部骨片能提供含骨髓干細胞的骨髓，而良好的接觸能確保來自于植骨床或自體骨塊的骨髓基質干細胞抵達陶瓷，從而促進陶瓷內部和周圍形成新骨，因此，行脊柱后路融合時必須將植骨床充分去皮質化，并使植骨塊或去皮質骨粒與鈣磷陶瓷充分混合，使其相互接觸，才能確保較多地骨長

21、入。雙相鈣磷陶瓷的生物降解過程較復雜，機械磨擦、化學溶解、細胞吞噬及細胞活動產生的酸性環境都能使其降解6。此外，陶瓷的燒結工藝對陶瓷的降解有重要的影響。為了保證雙相鈣磷陶瓷中的有效成份，燒結溫度往往較低，使磷酸三鈣顆粒、羥基磷灰石晶體間的連接較弱，植入體內后易形成降解顆粒，誘發細胞吞噬反應6, 7。由于羥基磷灰石顆粒較難溶解，細胞吞噬后會引起細胞損傷，從而影響骨形成和脊柱融合7。由于本研究中最早的病例和最遲的病例相差達8年之多，使用的雙相陶瓷可來自不同的批號，這些因素都可影響本研究中各標本的成骨和降解。 本研究所有病例在植骨融合的同時都進行了內固定術，因此所有植入的雙相陶瓷具有穩定的生物力學環

22、境，但從嚴格意義上說，脊柱后側和后外側融合的生物力學環境不盡相同，動物實驗表明橫突間融合術陶瓷的新骨形成率明顯低于椎板間融合術。本研究部份病例的融合部位在腰段，標本的取材部位可為椎板、關節突或橫突間。由于具體活檢部位的記載不夠詳盡，因此不能進一步分析這些差異，今后根據不同植入部位進一步研究有助于闡明這些差異。 4 致 謝 感謝法國Calot醫院骨科Chopin醫師和Morin醫師熱情地提供臨床標本，感謝法國Littoral大學生物材料和生物技術研究所Hardouin教授對研究所作的悉心指導?！緟⒖嘉墨I】 1 Delecrin J, Deschamps C, Romih M, et al. Influence of bone environment on ceramic osteointegration in spinal fusion: comparison of bonepoor and bonerich sitesJ. Eur Spine J, 2001,10:110-113.2 Fujibayashi S, Shikata J, Tanaka C, et al. Lumbar posterolateral fusion with biphasic calcium phosphate ceramicJ. J Spi