1、S 58文章編號(hào):1007-8738(2005 S -0058-02噬菌體抗體庫篩選技術(shù)研究進(jìn)展薛國柱綜述竇科峰審閱(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科, 陜西西安710032關(guān)鍵詞噬菌體庫; 抗體; 抗體篩選; 腫瘤中圖分類號(hào)Q782文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A噬菌體抗體是指在其表面表達(dá)有Fab 抗體或單鏈抗體(scFv 的噬菌體。用基因克隆技術(shù)將B 細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來, 組裝到表達(dá)載體內(nèi)并表達(dá)到噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體, 即為噬菌體抗體庫1。經(jīng)特定抗原或細(xì)胞篩選后, 便可獲得特異性抗體。噬菌體抗體庫的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟2, 3。1噬菌體呈現(xiàn)人抗體庫的基本原理噬菌體抗體在膜表面表達(dá), 是通過Fab

2、 段或ScFv 與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白形成融合蛋白而完成。其特點(diǎn)是“它既可識(shí)別相應(yīng)的抗原并與其結(jié)合, 又能夠感染宿主菌進(jìn)行再擴(kuò)增”。利用其可再擴(kuò)增的特性, 以靶抗原通過親和吸附2洗脫2擴(kuò)增, 可篩選到靶分子的配體肽鏈4。再經(jīng)突變和鏈置換方法改進(jìn)抗體親和力, 最終便獲得高親和力的特異性抗體。噬菌體抗體庫的篩選包括兩個(gè)主要步驟:淘篩和鑒定5。淘篩(panning 是將噬菌體抗體庫與選擇用的抗原共同孵育, 通過幾輪洗脫, 收集結(jié)合的噬菌體。將獲得的噬菌體感染細(xì)菌并擴(kuò)增, 再進(jìn)行下一輪的淘篩。經(jīng)幾輪淘篩后, 便可富集到與抗原特異性結(jié)合的噬菌體感染的多克隆菌株。鑒定過程是從噬菌體感染的多克隆菌株中挑選出單

3、克隆菌株。即將淘篩出的噬菌體感染細(xì)菌、鋪板、挑選, 即可得到高特異性單克隆菌株。2噬菌體抗體庫的篩選方法噬菌體抗體庫的篩選, 需要對(duì)許多條件優(yōu)化, 包括噬菌體的制備及其滴度, 其中更重要的是要優(yōu)化篩選策略。2. 1固相或液相純化抗原的篩選用純化或重組的抗原從噬菌體抗體庫中篩選展示特異性抗體的噬菌體的傳統(tǒng)方法主要有:(1 將純抗原包被在固相介質(zhì)上, 如酶標(biāo)板、免疫試管或親和層析柱, 然后加入待篩選的噬菌體, 洗去非親和性或低親和性的噬菌體, 回收高親和性的噬菌體。(2 將抗原與生物素基團(tuán)相連, 再將其固定在包被有鏈親和素(strep tavi 2din 的磁珠上對(duì)噬菌體進(jìn)行篩選。生物素化的抗原與

4、磁珠結(jié)合后, 再通過磁場(chǎng)的作用將結(jié)合抗原的噬菌體與未結(jié)合抗原的噬菌體分開6, 7。為了提高的篩選效率, 可對(duì)固體篩選的傳統(tǒng)方法不斷改進(jìn), 如將噬菌體感染宿主菌的過程與篩選過程相聯(lián)合, 可產(chǎn)生選擇性感染噬菌體(selectively infected收稿日期:2004-03-22; 修回日期:2004-05-08基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No . 30371399作者簡(jiǎn)介:薛國柱(1966- , 男, 河南新野人, 副主任醫(yī)師, 博士生.Tel:(029 83375259; Email:xgzh2003yahoo. com. cnphage, SI P 篩選系統(tǒng)8。針對(duì)細(xì)胞表面抗原等抗

5、原難以純化的, 可采用抗抗體替代抗原進(jìn)行篩選9。傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)中, 基因重組噬菌體中會(huì)有野生型的p 蛋白存在, 因此, 重組噬菌體仍具有感染能力。這樣在篩選后擴(kuò)增時(shí), 特異性和非特異性的噬菌體均可進(jìn)入宿主菌增殖。SI P 篩選系統(tǒng), 是將篩選和擴(kuò)增合并為一步, 只有特異性的噬菌體才能感染宿主菌中擴(kuò)增, 而非特異性的噬菌體則不能。這樣, 不僅可簡(jiǎn)化篩選的步驟, 而且可大幅度地提高篩選效率8。另一種思路是用抗獨(dú)特型(anti 2idi otyp ic, A I d 抗體替代細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行篩選。在抗細(xì)胞表面抗原的mAb 可以制備并提純的條件下, 用該mAb 作為抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)也可得到抗體?？箍贵w

6、的某些表位和抗原的一些表位可以采用經(jīng)典的方法進(jìn)行篩選。Hombach 等10以抗C D30的抗抗體替代CD30(在Hodgkin 淋巴癌細(xì)胞膜上過度表達(dá) 篩選抗C D30的scFv 噬菌體抗體庫, 僅1輪篩選就獲得了親和性較高的抗CD30scFv 。2. 2全細(xì)胞篩選目前文獻(xiàn)報(bào)道的特異性噬菌體抗體, 多數(shù)是由固相純化抗原篩選得到的。對(duì)于無法提純或抗原性質(zhì)不確定的抗原(如癌細(xì)胞表面受體 , 采用傳統(tǒng)的篩選方法可使抗原失活, 如某些膜蛋白, 因此, 需建立新的篩選系統(tǒng)或?qū)鹘y(tǒng)的篩選技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)10,11。由于膜蛋白密度的差異及膜分子暴露程度的不同, 對(duì)未知抗原的分離鑒定有很大困難, 因而在很長(zhǎng)一段

7、時(shí)間內(nèi)抗體庫沒有被用于對(duì)腫瘤特異性抗體的篩選11。最近, 直接用腫瘤細(xì)胞從單鏈?zhǔn)删w抗體庫中篩選腫瘤特異性抗體已有報(bào)道。如Kup sch 等12篩選出與黑色素瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體。R idg way 等13采用先將正常支氣管上皮細(xì)胞系與非特異性的噬菌體抗體清除后, 再用肺腺癌細(xì)胞系進(jìn)行篩選的方法, 得到抗C D55的單鏈抗體。但即使這樣, 其篩選效率仍較低, 而且容易丟失親和性高的噬菌體。Siegel 等報(bào)道了磁性細(xì)胞分離法(magnetically 2activated cell s orting, MACS 。即用抗原陽性的細(xì)胞包裹磁珠, 然后與大量抗原陰性的細(xì)胞混合, 加入待篩選的噬菌

8、體作用后, 再通過磁柱快速分離結(jié)合特異性噬菌體的抗原陽性細(xì)胞。他們采用MACS 法, 以人血紅細(xì)胞Rh (D +細(xì)胞為靶細(xì)胞, Rh (D -細(xì)胞吸收非特異性噬菌體,成功地從Fab 噬菌體抗體庫中篩選出一系列抗Rh (D 的抗體。研究表明, 噬菌體抗體庫不僅可通過與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行篩選, 而且可通過細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)行篩選14。由于配體和受體結(jié)合后可經(jīng)細(xì)胞內(nèi)化的方式將配體2受體的復(fù)合體吞入細(xì)胞內(nèi)。而抗體與抗原的結(jié)合可模擬這一過程, 故可采用這一方法來篩選可被細(xì)胞內(nèi)化的抗體。本法的基本步驟是:先用不表達(dá)某一抗原的細(xì)胞吸附抗體庫后, 再將吸附后的抗體庫與表達(dá)某一抗原的細(xì)胞于37孵育15m in, 以使特異性抗

9、體被內(nèi)化入細(xì)胞。然后用酸性洗脫液洗去與細(xì)胞膜非特異結(jié)合的噬菌體S 59并裂解細(xì)胞, 再用裂解液中的特異性噬菌體感染細(xì)菌。由于酸性洗脫液對(duì)于噬菌體的感染有一定影響, 所以洗脫液的酸度不可能太大, 這樣做不能最大限度地去除非特異性噬菌體。瘤的mAb 片段, 這些mAb 片段與細(xì)胞毒素、破壞細(xì)胞的酶和細(xì)胞因子等連接后, 可形成對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性殺傷作用的復(fù)合物, 稱為免疫毒素或生物導(dǎo)彈。用連接放射性核素的抗但由于在特異性噬菌體已被內(nèi)化后才開始洗脫, 所以可增加洗脫液的酸度而不必?fù)?dān)心特異性噬菌體的感染能力14。2. 3用切片組織進(jìn)行篩選為更接近于臨床應(yīng)用, 篩選到真正與人腫瘤組織特異的噬菌體, Tor

10、ds on 等報(bào)道用冰凍組織切片來進(jìn)行篩選。但回收和富集的噬菌體較少, 原因可能是所含抗原的量有限。2. 4體內(nèi)篩選M utuberria 等報(bào)道將表達(dá)EGF 22的大腸癌細(xì)胞系接種于裸鼠, 然后從裸鼠的尾靜脈注入噬菌體抗體庫, 在不同的時(shí)間處死裸鼠, 回收組織內(nèi)的噬菌體。Johns 等用類似方法在小鼠胸腺內(nèi)篩選出抗內(nèi)皮細(xì)胞的特異性單鏈抗體。這一方法更適合于分離針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性的噬菌體抗體。3影響篩選效率的因素庫容量、固相介質(zhì)表面抗原的密度及溶液中抗原的濃度和清洗時(shí)間, 對(duì)噬菌體抗體的篩選效率均有較大影響。根據(jù)噬菌體抗體庫的容量和不同的篩選目的, 選擇適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)度的篩選條件, 對(duì)篩選

11、的效率至關(guān)重要。嚴(yán)謹(jǐn)度過高, 可使一些表達(dá)較低的克隆被篩掉, 而這些克隆中可能含有親和性極高的目的噬菌體; 嚴(yán)謹(jǐn)度過低, 又可導(dǎo)致噬菌體的富集過程太慢, 篩選輪數(shù)增加。通常篩選庫容量較小的抗體庫(107108時(shí), 在前幾輪采用中等的嚴(yán)謹(jǐn)度有利于避免高親和性低表達(dá)的克隆的丟失; 而對(duì)較大的抗體庫的篩選, 則可采用較高的嚴(yán)謹(jǐn)度以較快地富集親和性克隆5。4篩選效率的檢測(cè)在噬菌體篩選過程中, 還常常存在“插入丟失克隆”的現(xiàn)象, 即使展示Fab 或scFv 的噬菌體克隆丟失。因此, 對(duì)每一輪篩選后都要進(jìn)行以下檢測(cè):(1 感染的噬菌體數(shù)。它可隨著篩選輪數(shù)的增加而增加。(2 抗體基因插入載體的頻率。由于噬菌

12、體展示的一個(gè)突出問題是外源基因的部分或全部丟失, 因此, 有必要用PCR 法檢測(cè)被洗脫的噬菌體感染的大腸桿菌克隆。(3 親和性。隨機(jī)選擇一些被洗脫的噬菌體感染的宿大腸桿菌克隆, 用E L I S A 鑒定洗脫的噬菌體的親和性5。5抗體庫篩選技術(shù)的應(yīng)用前景噬菌體抗體庫技術(shù)使mAb 的制備變得簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定有效。而這一技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)是, 如何在最大限度地減少非特異性噬菌體結(jié)合的同時(shí), 最大限度地富集特異性噬菌體, 因此篩選方法的改進(jìn)始終是該技術(shù)發(fā)展的動(dòng)力2,5。噬菌體抗體對(duì)感染性疾病、器官移植排斥反應(yīng)的防治及腫瘤的早期診斷、治療, 以及手術(shù)及化療后晚期腫瘤的輔助治療均具有廣闊的應(yīng)用前景1,4。在器

13、官移植方面, 抗I L 22R 靶向mAb 的研制, 是繼Cs A 及FK506等有效阻斷I L 22與T細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮抗排斥作用的又一新途徑。因此, 針對(duì)I L 22/I L 22R 系統(tǒng)的抗體庫及其篩選技術(shù), 將在治療器官移植的急性排斥中發(fā)揮重要的作用。在腫瘤診斷及治療方面, 利用抗體庫及其篩選技術(shù)可簡(jiǎn)便地制備出針對(duì)不同腫瘤患者多種腫體可進(jìn)行放射免疫成像定位, 已成一種很有前途的腫瘤治療診斷方法5。噬菌體可內(nèi)化入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞, 細(xì)胞內(nèi)化抗體的篩選對(duì)抗體和抗體介導(dǎo)的靶向藥物的治療尤為重要4,5。直接從噬菌體抗體庫中篩選能特異性結(jié)合到細(xì)胞表面并能進(jìn)行一系列內(nèi)化的抗體, 為尋找適于抗癌治療的全人

14、源化抗體開辟了一條新途徑。參考文獻(xiàn):1W illats W G . Phage dis p lay:p racticalities and p r os pectsJ .PlantM ol B iol , 2002, 50(6 :837-854.2Ladner RC . Phage dis p lay and phar macogenom ics J .Phar m acog 2eno m ics , 2000, 1(2 :199-202.3W inthr op MD, Denardo G L, Denardo SJ. Antibody phage dis p lay ap 2p licati

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