1、    gp130單克隆抗體B-S12的生物學特性研究        摘要：目的研究gp130單克隆抗體B-S12的生物學特性。 方法用細胞計數和3H-TdR摻入的方法觀察人多發性骨髓瘤細胞株XG-1和XG-2在抗gp130的單抗B-S12與它們的Fab片段和F(ab)2片段作用下，細胞增殖和生長情況；此外，也觀察gp130單抗B-P8以及IL-6和IL-6R單抗B-E8和B-R6對B-S12單抗在這2個細胞株上作用的影響。 結果B-S12可刺激XG-1和XG-2細胞增殖，并

2、維持它們的長期生長，但B-S12的這些作用有賴于它保持完整的二價結合力。B-E8和B-R6對B-S12的作用無影響，B-P8則可協同增強B-S12的作用。 結論B-S12為刺激型抗gp130的單抗，可起著類似于IL-6的作用。關鍵詞：gp130分子； 單克隆抗體； 細胞因子Study on biological characteristics of gp130 monoclonal antibody B-S12GU ZongjiangLU ZhaoyangQIU Yuhua, et al（Immunology Research Unit, Suzhou Medical College, Suz

3、hou 215007, P.R.China）Abstract：ObjectiveTo study the biological characteristics of gp130 monoclonal antibody (McAb) B-S12. MethodsCell count and 3H-TdR incorporation were used to assess the cellular proliferation and growth of human multiple myeloma cell lines XG-1 and XG-2 stimulated by both B-S12

4、and the Fab and F(ab)2 fragments. In addition, the influences of anther gp130 McAb B-P8, IL-6 McAb B-E8 and IL-6R McAb B-R6 on the effects of B-S12 on the proliferation of XG-1 and XG-2 cells were observed. ResultsB-S12 stimulated proliferation of XG-1 and XG-2 cells, and supported their long-term g

5、rowth. But, the effect of B-S12 was dependent on keeping its intact binding ability. B-E8 and B-R6 had no influence on the effect of B-S12, while B-P8 could synergize and augment its effect. ConclusionB-S12 is a stimulating gp130 McAb, and play a similar role to that of IL-6.Key words：gp130 molecule

6、; Monoclonal antibody; Cytokinegp130分子是白細胞介素-6（IL-6）的信號傳導鏈。IL-6和IL-6受體（IL-6R）結合形成復合物后，可以與2個gp130分子結合，使之同二聚化，從而導致胞漿內信號傳導途徑的活化，引起信號傳遞。以后又發現IL-11、制瘤素（OM）、白血病抑制因子（LIF）、睫狀神經營養因子（CNTF）和心肌營養因子（CT-1），也使用gp130分子作為信號傳導鏈，其中IL-11的作用方式與IL-6相同，其余4個細胞因子則引起gp130分子與gp190分子（LIF受體）發生異二聚化，導致胞漿內信號傳遞。因此，gp130在上述細胞因子的生物學活

7、性中起著重要作用，這些細胞因子也可被稱為gp130細胞因子1。為了更好地理解gp130分子與gp130細胞因子之間的相互作用，我們曾制備了一組抗gp130分子的單克隆抗體，并首次證實gp130分子上的不同位點涉及不同gp130細胞因子的生物學活性2,3，同時，我們將所獲得的15株抗gp130分子的單抗根據它們對gp130分子的作用分成三個組2：（1）抑制型，（2）刺激型，（3）無影響型。本文報告刺激型抗gp130的單抗B-S12的生物學特性。材料和方法試劑：重組人IL-6由法國Klein博士贈送，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶為Sigma公司產品。gp130單克隆抗體B-S12和B-P8由本室研制2，B

8、-S12的Fab片段和F(ab)2片段分別由木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶切后得到。中和性抗IL-6和IL-6R的單克隆抗體B-E8和B-R6由法國Wijdenes博士提供。細胞：XG-1和XG-2是人多發性骨髓瘤（MM）細胞，由本室建立4。它們有胞漿內免疫球蛋白（Ig），膜上表達漿細胞抗原（CD38和syndecan-1），但不表達B細胞抗原CD19和CD20。它們的生長依賴于外源性IL-6，被常規置于含10%FCS和3ng/ml的IL-6培養基中培養。XG-1和XG-2細胞系的其它特性見參考文獻5和6。這2個MM細胞系經支原體的ELISA檢測試劑盒（Boehringer德國）檢測，證實無支原體污染

9、后用于下述實驗。XG-1和XG-2細胞的增殖和抑制實驗：將XG-1和XG-2洗滌1遍，然后以無IL-6的培養基在37培養4h，再洗滌1遍后，以每孔5000個細胞加入96孔板中，然后分別加入各種不同濃度的B-S12抗體，37，5% CO2培養箱中培養5d，加入18.5kBq(0.5Ci)/孔的3H-TdR繼續培養8h，收集細胞，用液閃儀（Beckman）測定cpm數，觀察不同B-S12抗體濃度對XG-1和XG-2細胞的刺激增殖作用，并從中選出B-S12抗體的最佳和亞適刺激濃度。做以下實驗：（1）以B-S12最佳抗體濃度與中和性抗體B-E8(10g/ml)和B-R6(10g/ml)配合作抑制實驗。

10、觀察B-E8和B-R6對B-S12的作用有無影響；（2）以B-S12的亞適刺激濃度與B-P8作配合，觀察B-P8抗體對B-S12抗體的增強作用。（3）當觀察B-S12的Fab片段和F(ab)2片段對XG-1和XG-2細胞的作用時，這2個片段的濃度都取相同于B-S12的最佳濃度。在上述后面的3個實驗中，都設置IL-6和無關抗體分別作為陽性和陰性對照。XG-1和XG-2細胞的長期生長實驗：將XG-1和XG-2的起始細胞濃度均調整為105/ml，加入上述B-S12的最佳抗體濃度，每隔4d計數細胞，并稀釋細胞，同時補充含B-S12抗體的新鮮培養液，繼續培養。結果1.gp130單克隆抗體B-S12可代替

11、IL-6刺激XG-1和XG-2細胞增殖：XG-1和XG-2細胞的生長需要外源性的IL-6，在無外源性IL-6的情況下，XG-1和XG-2細胞在短期內就可死亡。但B-S12可刺激XG-1和XG-2細胞增殖（1），說明B-S12抗體完全可以替代IL-6。從1中可看見，B-S12的濃度在30ng/ml時，對這2個細胞就有弱的刺激作用，隨著B-S12濃度的逐步增強，在1g/ml時，就可使XG-1和XG-2的增殖接近或達到高峰。因此，在以下的實驗中，就選用1g/ml作為最佳刺激濃度，同時選用100ng/ml作為亞適刺激濃度。2.B-S12可維持XG-1和XG-2細胞在體外的長期生長：以含1g/ml B-

12、S12的培養液對XG-1和XG-2細胞作長期培養，并每隔4d進行計數，隨著培養時間的延長，XG-1和XG-2的細胞數也隨之增加（2）。綜合1和2結果，說明gp130單抗B-S12對MM細胞XG-1和XG-2起著類似IL-6的作用，即生長因子樣的作用。1B-S12單抗刺激XG-1和XG-2細胞增殖Fig 1. Proliferation of XG-1 and XG-2 cells stimulated by B-S12 McAb2B-S12單抗支持XG-1和XG-2細胞的長期生長Fig 2. Long term growth of XG-1 and XG-2 cells supported b

13、y B-S12 McAb 3.IL-6和IL-6R的單抗B-E8和B-R6對B-S12在XG-1和XG-2細胞上的作用無影響：為了調查B-S12抗體對XG-1和XG-2細胞的作用是否為直接作用，我們觀察了B-E8和B-R6抗體對B-S12作用的影響。結果顯示（3），B-E8和B-R6抗體能夠很好地抑制IL-6對XG-1和XG-2細胞引起的增殖；但對B-S12抗體引起的這兩株MM細胞的增殖無抑制作用。這說明B-S12引起的XG-1和XG-2細胞的增殖是直接作用，不是通過gp130分子的胞內信號傳導途徑激活了細胞內的某些核因子所引起的IL-6基因的活化和自分泌而導致的細胞增殖。4.B-S12抗體的

14、Fab片段失去刺激活性：用木瓜酶和胃蛋白酶消化B-S12抗體，分別得到Fab和F(ab)2片段，然后檢測這2個片段是否還保留著B-S12的生物學功能。4的結果表明，Fab片段完全失去了刺激XG-2細胞增殖的作用，而F(ab)2還保留著和B-S12抗體一樣的刺激功能，說明保留B-S12的雙價結合能力，對保持其生物學功能起著重要作用。在XG-1細胞上，我們也可以得到類似結果（結果未顯示）。3B-E8和B-R6對B-S12在XG-1和XG-2細胞上的增殖作用無影響Fig 3. No influence of B-E8 and B-R6 on the effect of B-S12 on the pr

15、oliferation of XG-1 and XG-2 cells4BS-12的F(ab)2和Fab片段對XG-2細胞增殖的不同作用Fig 4. Different effect of F(ab)2 and Fab fragments of B-S12 on the proliferation of XG-2 cellsA: IL-6; B: B-S12; C: F(ab')2; D: Fab; E: neg ctr 5.gp130單抗B-P8可協助加強B-S12抗體的功能：B-P8抗體在濃度為100ng/ml時，單獨對XG-2細胞無作用（5），但當它和B-S12抗體（100ng/m

16、l）合用時，增強B-S12抗體對XG-2細胞的刺激增殖作用（5）。同樣，B-P8和B-S12抗體合用，在XG-1細胞上也可獲得相同的結果（結果未顯示）。5B-P8增強B-S12在XG-2細胞上的增殖作用Fig 5. Enhamced influence of B-P8 on the effect of B-S12 on the proliferation of XG-2 cells 討論IL-6是MM細胞在體內和體外最重要的生長因子。同時也是MM細胞的一個主要生存和抗凋亡因子。利用IL-6，可以從處于漿細胞性白血病(即終末階段)的MM病人的細胞中，在體外建立依賴于IL-6的人多發性骨髓瘤細胞株

17、7。但IL-6在發揮上述作用時，必須依賴于MM細胞膜上同時表達IL-6R和gp130分子，并通過gp130分子，將胞外的信號傳遞至胞漿內，活化胞漿內的信號傳遞。但gp130單抗B-S12可以在IL-6和IL-6R不存在的情況下，直接激活MM細胞XG-1和XG-2膜上的gp130分子，導致這2個細胞的增殖，并可維持它們的長期生存。盡管B-S12抗體在低濃度時不能刺激XG-1和XG-2細胞增殖，但可維持它們的存活和防止凋亡，說明B-S12在體外對MM細胞起著類似于IL-6的作用。這種作用的產生，有賴于B-S12抗體保留完整的二價結合能力，并和2個gp130分子結合，導致gp130分子的同二聚體化，

18、最終使B-S12抗體的生物學效應產生。盡管我們已制備了一組抗gp130分子的單克隆抗體，并且通過其中的部分單抗，首次證明了在gp130分子上的不同位點，涉及不同的gp130細胞因子的活動2，3，但在這一組單抗中，我們僅僅篩選出對CNTF有抑制作用的B-P8單抗可以協同增強B-S12的作用。可能是B-P8作用于gp130分子后，使得gp130分子在空間上更為相互接近，從而有利于B-S12單抗發揮作用，但確切的機制有待于進一步詳細研究。利用B-S12的生長因子樣作用和B-P8協同B-S12作用的特點，我們已成功地用這2個抗體在體外取代IL-6，進行了MM細胞的建系工作，具體結果將另文報道。在人MM

19、的免疫治療實驗中，需要在SCID小鼠體內建立MM的動物模型。但MM細胞在SCID小鼠體內生長時，也需給予IL-6。IL-6是個炎癥因子，它除了支持MM細胞在SCID小鼠體內生長，也可作用小鼠的相關細胞，引起炎癥反應。另外，IL-6在體內的半衰期較短，需經常給予，這樣會加重SCID小鼠體內的炎癥反應。B-S12和B-P8單抗可在體內取代IL-6，用于MM細胞在SCID小鼠體內的生長，這樣可以避免IL-6所引起的一些對SCID小鼠的不利反應，而且單抗在體內的半衰期遠較IL-6為長，可避免在短期內反復給予8。基金項目：國家教委留學回國人員基金資助項目（97-436）作者單位：顧宗江（蘇州醫學院免疫研

20、究室）陸肇陽（蘇州醫學院免疫研究室）邱玉華（蘇州醫學院免疫研究室）張學光（蘇州醫學院免疫研究室）參考文獻：1Kishimoto T, A kira S, Narazaki M, et al. Interleukin-6 family of cytokines and gp130. Blood, 1995, 86:1234-1254.2Gu ZJ, Wijdenes J, Zhang XG, et al. Anti-gp 130 transducer monoclonal antibodies specifically inhibiting ciliary neurotrophic factor

21、, interleukin-6,interleukin-11, leukemia inhibitory factor or oncostatin M. J Immunol Methods, 1996, 190:21-27.3顧宗江，張學光. gp130單克隆抗體（B-K5）抑制OM的生物學活性.中華微生物學和免疫學雜志，1998，18（3）：243-245.4Zhang XG, Gaillard JP, Robillard N, et al. Reproducible obtaining of human myeloma cell lines as a model for tumor stem cell study in human multi