1、引致豬繁殖障礙病的6種病毒低密度基因芯片檢測方法的建立高淑霞1,3 吳時友2 莊文忠4 尹燕博2 牛鐘相3*摘要 應用PCR（或RT-PCR）分別擴增豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒-2型、日本乙型腦炎病毒和豬瘟病毒的一段保守序列，克隆到pMD 18-T Simple Vector構建重組質粒，用于制備各病毒的探針。將各探針按一定的陣列點硝酸纖維素膜上后加以固定，制備低密度檢測基因芯片。在多重PCR擴增過程中用生物素標記的dUTP(Bio-11-dUTP)對待檢樣品進行標記，擴增產物與芯片雜交，用掃描儀對雜交結果進行掃描分析。應用該檢測方法可以同時檢測到待檢樣品

2、中上述6種病毒核酸的存在與否，達到鑒別診斷的目的。關鍵詞 繁殖障礙 基因芯片 多重PCR 核酸雜交目前,我國豬傳染病流行的主要特點是：多病原混合感染，繁殖障礙性傳染病普遍存在，呼吸道傳染病日益突出。豬繁殖障礙的主要臨床癥狀為：母豬不孕、早產、產死胎、木乃伊胎和弱胎等。引發豬繁殖障礙性傳染病的主要病毒有：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV, porcine reproductive and respiratory syndrome virus)、豬偽狂犬病病毒(PRV, porcine psudorabies virus)、豬細小病毒(PPV, porcine parvovirus)、豬圓環病毒

3、2型(PCV2, porcine cirocovirus-2)、日本乙型腦炎病毒(JEV, Japanese B encephalitis virus)和豬瘟病毒(CSFV, classical swine fever virus)、豬流感病毒（SI, swine influenza virus）。其它病原體還有豬布魯氏桿菌、豬衣原體、豬鉤端螺旋體和附紅細胞體等。一旦發生繁殖障礙性疾病，難以在臨床上確診，而且多為多病原體混合感染，更增加了診斷難度，必須借助實驗室方法。針對上述情況，本研究采用近年來發展的基因芯片技術，建立引致豬繁殖障礙的6種病毒（PRRSV、CSFV、PCV2、PPV、PRV、

4、JEV）低密度基因芯片檢測方法。本方法借助多重PCR、核酸雜交以及酶標技術建立一種一次多元的檢測方法。利用該方法可以對混合感染樣本中的6種病毒進行快速、準確的檢測，到同時達到鑒別診斷的目的。本檢測方法可以用于實驗室診斷、大面積的疾病流行病學調查以及動物及動物食品的檢驗檢疫。1 材料與方法1.1.1毒株 PRRSV、CSFV、PCV2、PPV、PRV、JEV毒株購自中監所。1.1.2菌種 受體菌E. coli JM109由山東澳蘭生物工程研究院保存。1.1.3主要試劑 Taq DNA polymerase、dNTP Mix、M-MLV、RNase Inhibitor購自上海生工。pMD 18-T

5、 Simple Vector、T4 DNA ligase購自大連寶生物。DNA recover kit購自V-gene生物技術有限公司。硝酸纖維素膜為MILLIPORE產品。1.2.1引物設計 根據Genbank以發表的病毒核酸序列，應用Oligo6.0設計各病毒的特異引物，由上海賽百盛合成。各病毒、引物序列以及擴增片段長度見表1。表1引物設計的病毒、引物序列及擴增片段長度Table 1 virus, primer sequence and product length病毒virus引物序列primer sequence擴增片段長度product length bpPRRSV5-cgc aca

6、 ggc tgt gcg aga aaa-35-gat gcg aga tca gct tca agg-3255CSFV5-gct cct ggt tgg taa cct cgg-35- tga tgc tgt cac aca ggt gaa-3508PCV-25-tgg ctg ccc tgg gat gat cta-3 5-tcc tac cac tcc cgc tat ttc-3565PPV5-gca gta cca att cat ctt ct-35-tgg tct cct tct gtg gta gg-3588PRV5-ccg cgg gcc gtg ttc ttt gt-35-gt

7、c cac cgg gcg cag gca ctc g-3300JEV5-cat tcc aag cga agc agg aga tcc-35-gac gtc caa tgt tgg ttt gtc g-33751.2.2 重組質粒的構建 采用PCR或RT-PCR獲得病毒核酸的DNA或cDNA片段，純化回收后用pMD 18-T Simple vector構建重組質粒,轉化大腸桿菌JM109感受態細胞,篩選陽性克隆,進行PCR及測序鑒定。 各陽性質粒分別記作pMD18-PRRS、pMD18-CSF、pMD18-PC2、pMD18-PP、pMD18-PR、pMD18-JE。1.2.3芯片的制備 1

8、.2.3.1探針的制備 分別提取細菌質粒，PCR擴增目的片斷，擴增產物電泳切膠回收，測定濃度，調整濃度為200ng/l，100變性5min，冰浴5min，-20保存備用。點膜 cm2的正方形，固定到特制的塑料盒底部。芯片采用4*4陣列，每條病毒探針、陽性對照、陰性對照各2個位點。陽性對照為豬的一段珠蛋白基因（S），陰性對照為一段植物基因 (P)。將各探針和對照按圖1設計好的排列方式加樣至16孔加樣槽，點樣后，80，固定2h，封膜，4保存備用。 SPRRSCSFPC2SPRRSCSFPC2PPVPRVJEVPPPVPRVJEVP圖1芯片陣列分布圖Fig1 Array distrib

9、ution 提取病毒核酸 取病毒細胞培養液200µl，加入800µl裂解液，震蕩混勻后靜置5min，加入400µl氯仿，震蕩混勻, 12000rpm離心10min，取上清，加入400µl -20預冷的異丙醇，室溫沉淀30min，75%乙醇洗滌一次，棄上清，沉淀自然干燥。 反轉錄 用混合引物（RNA病毒引物的等比混合）對病毒核酸進行反轉錄。反轉錄體系：5×Buffer 4µµl，M-MLV reverse transcriptase 40u，RNase Inhibitor 40u，加DEPC H2O

10、至20µl，溶解提取的病毒核酸, 42，1h。 PCR 所用引物為混合引物（8對引物的等比例混合），在此過程中摻入Biotin-11-dUTP，對樣品進行標記。PCR體系為：10×µl，Mg2+µµl，dUTP 3µl, Taq DNA polymerase (5U/µµl，Mixture primer（50pmol/µl）4µµl，加ddH2O至25µl循環參數為：95預變性5min；94變性30s，56退火40s，72延伸60s，30個循環；72終延伸5mi

11、n。1.2.5芯片雜交 雜交過程在雜交儀上進行。 預雜交 每片芯片加450l預雜交液，42，預雜交40min。 雜交 棄掉預雜交液，將20l標記 PCR產物l00變性5min，置冰水中5min，與400l雜交液混合，加到芯片盒中。58，雜交1h。 洗膜 用2×SSC、0.1%SDS洗滌3次，每次1min。再用×SSC、0.1%SDS洗滌3次，每次1min。 酶聯 加400l鏈親和素堿性磷酸酶酶聯液，酶聯20min。 顯色 洗滌液洗滌三次后，加400l底物液(BCIP/NBT)，顯色15min，用雙蒸水充分

12、沖洗芯片終止顯色，干燥后用于檢測。1.2.6雜交結果的檢測及結果判定 用芯片掃描儀檢測雜交結果，陽性對照呈陽性，陰性對照和空白對照呈陰性說明雜交過程正確。按以下標準判定檢測結果：0.1判定為陰性，0.2判定為陽性，介于0.1和0.2之間判定為可疑，同時輸出診斷報告。2 結果 目的片斷的擴增和純化將各病毒的PCR擴增產物5l進行1 瓊脂糖凝膠電泳，分別得到預期大小的片斷。用試劑盒純化回收目的片段。 探針陽性重組質粒的鑒定2.2.1 PCR鑒定 堿法小量提取質粒，分別用相應引物擴增，PCR產物電泳結果顯示重組質粒構建成功，結果見圖3。M 1 2 3 4 5 6 M2000bp1000bp750bp

13、500bp250bp100bpM, DNA Marker DL2,000；1-6分別為 PRRSV(255bp)、CSFV(508bp)、PCV-2(565bp)、PPV(588bp)、PRV(300bp)和JEV(375bp)的陽性重組質粒的PCR產物。M, DNA Marker DL2,000; Lane 1 to 6 is the PCR product of positive recombinant of PRRSV, CSFV, PCV-2, PPV, PRV and JEV respectively.2.2.2測序鑒定 分別提取6種病毒和6種病毒混合后的核酸，用混合引物進行標記PC

14、R或RT-標記PCR ，同時添加陽性對照的質粒模板。雜交結果見圖2-8。陽性對照呈陽性，陰性對照呈陰性，各病毒相應位點呈陽性。圖2 圖3 圖4 圖5 圖6 圖7 圖8Fig2 Fig3 Fig4 Fig5 Fig6 Fig7 Fig8圖2-7分別為PRRSV、CSFV、PCV-2、PPV、PRV和JEV的標記PCR產物與芯片雜交結果。圖8為6種病毒的混合。Fig 2 to 7 is the hybridized result of the labled PCR product of PRRSV, CSFV, PCV-2, PPV, PRV and JEV, respectively. Fig

15、8 is the the hybridized result of the labled PCR product of the mixture of six viruses.堿法小量提取pMD18T-PRRS質粒，測定質粒DNA濃度為70ng/l，10倍稀釋至10-12,對各稀釋度分別進行標記PCR后與芯片雜交。結果顯示，到10-11芯片仍有顯色，顏色較淺，掃描儀讀數<0.2，判為陰性，10-10為陽性。同時的PCR 產物電泳結果可以檢測到10-7。在本試驗中芯片的靈敏度比PCR高3個稀釋度。將病料與生理鹽水按15勻漿，反復凍融3次，離心，取上清液，提取總核酸，用混合引物進行RT-標記P

16、CR后與芯片雜交。檢測臨床疑似病料68份，與PCR檢測結果的比較見表2。從臨床病料檢測結果看，芯片的檢出率高于PCR方法，兩種方法的符合率大于90。檢出的病料多為混合感染，其中PRRSV和PCV-2的混合感染率最高，約占檢出病料的52（31/60）。說明豬繁殖障礙性傳染病主要是由多病原混合感染引起的。表2 臨床病料檢測結果(68份)Table 2 Detective results of clinical specimens with DNA-chip and PCR method檢測方法PRRSVCSFVPCV-2PPVPRVJEV芯片43333623333PCR393137212933討論

17、基因芯片（Gene chip），也叫做DNA芯片（DNA chip）、DNA 微陣列（DNA microarray），所用的探針為寡核苷酸或cDNA。其原理來源于Ed Southern提出的核酸雜交理論，傳統的印跡雜交可以看作是基因芯片的雛形。1995年美國斯坦福大學研制成功了第一塊以玻璃為載體的基因芯片。應用雙色熒光雜交檢測到擬南芥（Arabidopsis）45個基因的表達差異。自從Schena M等31995年在科學雜志發表這篇有關基因表達芯片的文章以來，以基因芯片為代表的生物芯片技術得到了迅猛發展，在生命科學領域發揮重要作用，作為一個技術平臺，已廣泛應用于基因圖譜繪制、基因表達譜分析、功

18、能基因組學研究、疾病診斷、藥物篩選、環境監測等多個領域。目前用于診斷病毒病的方法很多，但一次只能檢測樣品中的一種病原或抗體，本試驗建立的芯片檢測方法可以同時檢測六種病毒病原的存在與否，尤其適合用于臨床癥狀難于區分疾病的實驗室診斷。本方法同時引入了PCR、核酸雜交和酶標技術，減少了PCR假陽性，增加了檢測靈敏度，可以用于鑒別診斷、大面積的疾病流行病學調查以及動物及動物食品的檢驗檢疫。參考文獻1 殷震. 動物病毒學(第二版) M. 科學技術出版社, 1997.2 馬立人,蔣中華. 生物芯片M.化學工業出版社, 2000年2月.3Schena M, Shalon D, Davis RW, et al

19、. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. J Science. 1995 Oct 20;270(5235):467-70.4Pease AC, Solas D, et al. Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. J Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91(11):5022-6.5 Schena M, Shalon D, He

20、ller R, et al. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. J Proc Natl Acad Sci USA. 1996, 93(20):10614-10619.6 Kozal MJ, Shah N, et al. Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. J Nature Medic

21、ine,1996, 2(7): 753 -759.7Lipshutz RJ, Morris D,Chee M, et al. Using oligonucleotide probe arrays to access genetic diversity. J Biotechniques. 1995 ,19(3):442-447.8 Yershov G, Barsky V, et al. DNA analysing and diagnostics on oligonucleotide microarrays. J.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(10):4913-49

22、18.9 Zhu H, Cong JP, Mamtora G, et al. Cellular gene expression altered by human cytomegalovirus: global monitoring with oligonucleotide arrays. JProc Natl Acad Sci U S A. 1998 ,95(24):14470-14475.10 Chambers J, Angulo A, et al. DNA microarrays of the complex human cytomegalovirus genome: profiling

23、kinetic class with drug sensitivity of viral gene expression. J J Virol. 1999,73(7):5757-66.11 Linton D, Lawson AJ, et al. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J J Clin Microbiol. 1997 ,35(10)

24、:2568-72.12 Hughes MS, Ball NW, et al. Determination of the etiology of presumptive feline leprosy by 16S rRNA gene analysis. J J Clin Microbiol. 1997 ,35(10):2464-71.13 Gingeras TR, Ghandour G, et al. Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysi

25、s of generic Mycobacterium DNA arrays. J Genome Res. 1998 ,8(5):435-48.14 Head SR, Parikh K, et al.Solid-phase sequence scanning for drug resistance detection in tuberculosis. J Mol Cell Probes. 1999,13(2):81-7.15甘孟侯. 當前我國豬傳染病的發生特點及防治對策. J中國獸醫雜志, 2005,41(5):64-66.16翟俊輝,宋亞軍,等. 通用基因芯片檢測感染性細菌方法的研究. J中國

26、公共衛生 2003,19(4):430-431. 17吳海,顧少華等.檢測乙、丙型肝炎病毒基因芯片的制備. J第二軍醫大學學報,2001,22(6):527-530.18陶生策,楊仁全等.SARS冠狀病毒基因芯片的制作與初步臨床樣本驗證. J清華大學學報(自然科學版),2003,43(5):715-720.19周琦,賴平安等.基因芯片技術快速檢測SAAS病毒. J 年檢驗檢疫科學,2003,13(5):33-36.Study on Low Density DNA Array for Detecting Six VirusesRelated to Swine Reproductive DiseaseAbstract Conserved fragments of six viruses (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, classical swi