1、檢測乙肝表面抗原大蛋白應該采用其特異結構型表位抗體    大蛋白（nbsp;Lnbsp;蛋白nbsp;,nbsp;即nbsp;HBsAgnbsp;、nbsp;Pre-S1nbsp;蛋白和nbsp;Pre-S2nbsp;蛋白）在nbsp;HBVnbsp;形成包膜的過程中起關鍵性作用。nbsp;研究鴨乙肝病毒發現含有嗜肝病毒的血清的感染性不僅依賴于具有感染性的病毒顆粒（nbsp;Danenbsp;顆         魏紅山 ( 作者簡介：魏紅山，博士，副主任醫師，北京地壇醫院病毒

2、研究室主任。 drliver)    概要： 大蛋白（ L 蛋白 , 即 HBsAg 、 Pre-S1 蛋白和 Pre-S2 蛋白）在 HBV 形成包膜的過程中起關鍵性作用。 研究鴨乙肝病毒發現含有嗜肝病毒的血清的感染性不僅依賴于具有感染性的病毒顆粒（ Dane 顆粒）的多少，而且還依賴于缺乏核酸的亞 病毒顆粒的數量，研究發現亞病毒顆粒在 HBV 感染過程中，能顯著增強細胞內的病毒復制和基因表達，而這種增強作用是由大蛋白上的 pre-S 蛋白的反式激活作用所觸發的。因此檢測 L 蛋白 pre- 區蛋白的存在對于臨床上判定肝內 HBV 復制和治療預后具有一

3、定的意義。以往的檢測是通過檢測大蛋白的獨有片斷 Pre-S1 蛋白來實現的，但是編碼 pre-S 蛋白的 HBV-LP Pre-S 區具有復雜的拓撲結構，以往使用 Pre-S1 區 AA21-47 多肽作為免疫源制備單抗，導致 Pre-S1 抗原的檢出率較低，不能很好的反映 HBV 的復制情況。因此高敏感性檢測 L 蛋白的存在應該采用針對其特異拓撲結構區段的單抗。 全文： 乙肝病毒表面抗原（ HBsAg ）是 HBV 的外膜蛋白，由 HBV 基因組的 S 區所編碼， S 區分為 preS1 、 preS2 和 S 基因 3 段，它們閱讀框相位相同，連續串聯排列，可以共用 1 個終止密碼。這 3

4、 個基因分別編碼三種表面包膜蛋白：（ 1 ）主要表面蛋白：簡稱主蛋白，由 S 基因編碼，是病毒包膜及亞單位顆粒的主要成分，因其分子量小，因此稱之為小蛋白，傳統上 HBsAg 即指由 S 基因編碼的蛋白；（ 2 ）中等分子 S 蛋白（ M 蛋白），由 S 及 Pre-S2 基因區所編碼；（ 3 ）大分子 S 蛋白（ L 蛋白），由 S 、 Pre-S1 及 Pre-S2 基因區所編碼 【 1 】 。    圖 1 HBV S 基因編碼的三種蛋白與血清中三種顆粒的關系 HBV 感染者血清中有 3 種不同形態的病毒顆粒：小球形顆粒（直徑 22nm ）、管狀顆粒

5、（直徑 22nm 、長度 100-1000nm ）、 Dane 顆粒。 Dane 顆粒與管形顆粒的包膜蛋白組成相同，每個病毒含有 300 400 個分子的 S 蛋白與 40 80 個分子的 M 蛋白和 L 蛋白。小球形蛋白的包膜蛋白組成則隨病毒是否復制而異：在有病毒復制者中，小球形顆粒包膜上的 M 蛋白和 S 蛋白含量與 Dane 顆粒上的大致相同，存在 L 蛋白，但比例低于 1/20 ，形成管狀顆粒；在無病毒復制者中，小球形顆粒的包膜蛋白幾乎全部是 S 蛋白，無 L 蛋白，但是仍舊有 1 的 M 蛋白 【 2 】【 3 】 。在肝內病毒非復制期，大蛋白在血清中很低和無，大量滯留在肝細胞中。因

6、此可以根據檢測血液中大蛋白的有無，來判斷病毒攜帶者體內的 HBV 病毒是否在進行復制。 由于基因組較小，病毒都是利用盡可能小的多肽序列儲存盡可能多的信息。因此，很多由病毒編碼的蛋白和蛋白結構域都具有多種功能。乙型肝炎病毒的大蛋白（ L ）即是其中的一個例子。該蛋白在病毒進入時作為受體蛋白起作用； 在病毒組裝時，則是基質類似蛋白，同時還行使調節功能 【 4 】 。乙肝感染通常導致 10000 倍多于病毒粒子的管狀亞病毒顆粒 (subviral particles ， SVPs) 的合成。 SVPs 包含宿主細胞來源的脂質和病毒衣殼蛋白，但不具有病毒核衣殼蛋白和核酸 【 5 】 。乙型肝炎病毒 (

7、hepatitis B viruses,HBV) 的衣殼 L 蛋白，即大蛋白，在病毒生活周期中具有一系列不同的功能 : 感染早期，與細胞受體結合介導病毒粒子的細胞內攝入；感染晚期，他們對于病毒粒子的組裝和分泌十分重要 【 6 、 7 、 8 】 。 大蛋白的前 S 區具有獨特的立體構象拓撲結構，這個特殊的結構是 L 蛋白發揮多種功能作用的依賴性結構 【 9 】 。最新的研究證明大蛋白上的前 S 區 AA99-169 （橫跨部分前 S1 和前 S2 ）形成一個環狀，具有表面抗原眾多的免疫表位 【 10 】 ，其中 Arg 103 和 Ser 124 之間的序列在不同的 HBV 之間是高度保守的。

8、 Arg 103 和 Ser 124 之間的 pre-S 序列對于 HBV 的形成具有重要功能 【 11 】 ，而這個區段也是橫跨前 S1 和前 S2 的。 在組裝病毒外殼時，大蛋白在主蛋白和中蛋白的協同作用下，分泌出組裝完整病毒外殼，如果缺乏大蛋白，則只能形成不完整的病毒顆粒（球型顆粒）。研究鴨乙肝病毒發現含有嗜肝病毒的血清的感染性不僅依賴于具有感染性的病毒顆粒（ Dane 氏顆粒）的多少，而且還依賴于缺乏核酸的亞病毒顆粒的數量，研究還發現亞病毒顆粒在 HBV 感染過程中，能顯著增強細胞內的病毒復制和基因表達 , 而這種增強作用是由大蛋白上的 pre-S 蛋白的反式激活作用所觸發的 【 12

9、 】【 13 】 ，乙肝病毒表面抗原大蛋白研究發現乙肝病毒表面抗原大蛋白獨特的拓撲結構決定其具有反式激活作用， L 蛋白的前 S1 區和前 2 區有一個與翻譯不同步的轉位過程，在橫跨內質網膜時指向內質網的胞質側， L 蛋白上的前 S2 區段在翻譯后初期定位于內質網的胞質側，能夠激活多種啟動子元件，具有同樣的轉錄激活功能慢性 HBV 感染患者體內 L 蛋白持續過量表達，轉錄反式激活病毒的啟動元件與病毒復密切相關。    圖 2 乙型肝炎病毒包膜蛋白的跨膜拓撲學結構 蛋白 S 的跨膜折疊區域在 N 端的 I 型和內部的 II 型信號（空框表示）； C 端區域

10、為疏水區，被認為是包埋進脂雙層中（水平空框表示）； C 末端朝向內質網腔； N 聯聚糖殘基結合于腔環上，用小叉表示。蛋白 M 的折疊方式與 S 蛋白類似， N- 聯糖基化的 pre-S2 位于內質網腔。 L 蛋白具兩種拓撲結構。開始時 pre-S 結構域均位于胞質內（ i-preS ），約有一半的 L 蛋白會在翻譯后重折疊，而將 pre-S 結構域轉移進內質網膜的腔內一側（ e-preS ）。 L 蛋白 pre-S 結構域內潛在的 N- 聯糖基化位點用星號表示， S 蛋白的胞質環和 i-preS 結構域的某些區域可能在出芽過程時與衣殼相互作用，用方框表示。（ Volker Bruss. Env

11、elopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106(2004)199-209 ）    早在上個世紀 80 年代，關于大蛋白前 S 蛋白與乙肝病毒復制的關系已經引起了人們的廣泛注意，檢測的意義得到科研領域公認。但是局限于原來的生物技術水平，特別是結構生物學領域的認識和體外 pre-S 區段表達的困難，只能采用多肽合成 AA21-47 作為免疫源使得無法獲得針對 pre-S 區特有拓撲結構的抗體，因此檢測前 S 抗原檢測的手段缺乏，已經商品化的前 S1 試劑與 DNA 之間的符

12、合率不高，相關研究闡述不清，使得大蛋白前 S 區與病毒復制、疾病預后的研究不完整，臨床應用不廣。 對于前 S 區抗原檢測的研究，開始于 1984 年，德國科學家 KLAUS H. 等人使用乙肝感染者的血清分離出乙肝病毒顆粒，分離出一株單抗 MA18/7 ，但是該單抗后來確定為前 S1 區的線性表位 AA31-3 區段的單抗，沒有在臨床診斷中應用。 到 90 年代，從蛋白組成上認為前 S1 是 HBV 大蛋白的所獨有的片斷，因此它作為乙肝病毒復制的新標志一直是乙肝檢測領域研究的熱點 , 關于前 S 區的研究主要是將前 S1 和前 S2 作為兩個獨立的單元進行研究 【 14 】 。 90 年中期，

13、國內使用化學合成法合成多肽研制單抗，進行前 S1 的研究： 在我國已經有商品化的前 S1 定性檢測試劑（上海阿爾法公司），其單抗是用 AA21-47 化學合成的多肽而制作的 【 15 ， 16 】 。而應用該多肽免疫制作的抗體在科研中就已經發現，只能檢測到微弱的抗 -pre-S1 抗體的產生： Schodel 等人曾以 100ug 的 pre-S1(21-47) 合成多肽免疫 Balb/c 小鼠，誘導生成的抗 pre-s1 抗體的滴度只有 160 【 17 】 ，上海生化所改進應用 pre-S1-BSA 偶聯復合物免疫 Balb/c 小鼠，也只能檢測到微弱的抗 Pre-S1 的活力 【 16

14、】 ，應用該單抗制作的商品化試劑盒在實際使用中，也發現該前 S1 試劑試劑與兩個臨床較為公認的病毒復制的指標有一定相關性，但是三個指標差異較大，特別是前 S1 試劑與 DNA 的符合率與理論上有較大的差距。 90 年代末，在軍事醫學科學院馬賢凱等人使用基因重組的前 S 抗原（包括抗原 PreS1 ： 10 108 ， PreS2 ： 1 55 ）制備多抗組裝成試劑盒，在大三陽中的檢出率為 87 ，小三陽檢出率為 74 。其在大三陽中的檢出率較低，而小三陽的檢出偏高中，兩者之間沒有顯著的差異?？赡苁嵌嗫沟姆磻羞€有前 S2 片斷的反應。而前 S2 的蛋白不僅存在于大蛋白中，還是中蛋白的組成部分，

15、它與 HBV 復制的相關性不夠高。由于特異度不高，沒有見后來有相關的文章發表 【 18 】 。 此外由于 L 蛋白表達具有很強的細胞內滯留性，因此 L 蛋白前 S 抗原難以體外重組表達，同時該 L 蛋白極容易降解，因此將 L 蛋白前 S 區作為一個整體性對其蛋白功能研究相對較少。國內近期才完整表達前 S 區抗原成功 【 19 】 。 而在國外，針對前 S 區蛋白的整體性構象型蛋白研究日益受到重視 【 20 】 。從 90 年代到現在，德國法蘭克福州吉森大學（ University of Giessen, Frankfurter Strasse ）的 Bruss V 實驗室對大蛋白的結構、功能做

16、了重要的研究。在很多相關的研究中，前 S 區的特異拓撲結構和功能研究，使得結構型前 S 抗原作為大蛋白特征區域得到深入研究 【 21 】 。其研究證明大蛋白上的前 S 區 AA99-169 （橫跨部分前 S1 和前 S2 ）形成一個環狀，具有表面抗原眾多的免疫表位 【 22 】 ，其中 Arg 103 和 Ser 124 之間的序列在不同的 HBV 之間是高度保守的。 Arg 103 和 Ser 124 之間的 pre-S 序列對于 HBV 的形成具有重要功能 【 23 】 ，而這個區段也是橫跨前 S1 和前 S2 的。而由大蛋白組裝成的亞病毒顆粒能夠反式激活病毒繼續復制也有相關乙肝鴨模型證實

17、 【 12 】【 13 】 。這個對于臨床具有實際的意義，在臨床上，一定比例的小三陽病人抗病毒治療后 DNA 陰性（低拷貝數）但是存在亞病毒顆粒（前 S 抗原陽性）容易停藥反跳之間的關聯有新的啟示。 對于 HBV 外膜蛋白的深入研究，發現大蛋白在完整病毒外殼組裝過程中起著決定性作用 【 24 】 。整個前 S 區都暴露在病毒顆粒的表面，在與細胞受體的相互作用中發揮多點聯合的作用 【 25 】 ，同時發現前 S(S1+S2) 具有獨特拓撲結構，大蛋白在穿越內質網時需要形成雙重拓撲結構，大蛋白的折疊使前 S 區形成一個結構型依賴的區域 【 26 】 。而以往使用基因工程表達完整的 PreS 蛋白的

18、穩定性和溶解性較差 , 類似的研究很少有成功體外表達前 S 區蛋白的，而且也很難從血液中分離得到天然的 PreS 蛋白，因此無法對其結構進行深入研究和分析。 表位的構成方式至少有兩種： 由某些氨基酸殘基按一定順序連續排列組成的線狀序列，稱為順序（ sequential ）表位或線性 (linear) 表位。順序表位是蛋白分子的一級結構，比較穩定，不受蛋白質加熱變性和空間構形改變的影響。 由分子內不連續的 2 3 個氨基酸殘基折疊排列所形成的三維結構構成，稱為構象 (conformational) 表位；有時候，呈 螺旋式排列的連續肽鏈序列也可起到構象表位的作用。 病毒抗原的免疫檢測的研究中，大

19、多數都采用病毒的部分基因重組抗原或合成的多肽制作的單抗。近年來，人們逐漸認識到合成的多肽一般只具有線性表位，而不具有抗體所識別的構象型表位。當病毒的優勢抗原表位是具有立體空間構象型的抗原表位時，采用基因重組或合成肽的抗原制作的單抗其檢測病毒抗原的靈敏度必定受到影響 【 27 】 ，因此采用最好的辦法是采用病毒樣顆粒上的天然抗原決定簇或者能模擬其結構的重組蛋白來制作出針對其構象型表位的單克隆抗體。 因此 , 針對 L 蛋白拓撲結構的特異性單抗是檢測 L 蛋白的較好選擇 .    參考文獻 1 金奇 編著 醫學分子病毒學 科學出版社 2001 年 2 成軍

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