1、預(yù)測(cè)指標(biāo)：1.抗氧化酶系統(tǒng)、MDA2 .可溶蛋白、超氧陰離子自由基3.葉綠素、類胡蘿卜素4.可溶性糖5.游離氨基酸6.過(guò)氧化氫7 .谷胱甘肽、ASA1.抗氧化酶系統(tǒng)、MDAA酶活測(cè)定試齊I：PB賽沖液0.05MpH7.8:取0.663gNaH2PO42H2O和16.384gNa2HPO412H20力口PVP10g并加EDTA者EDTAa,使其濃度為2mM加蒸儲(chǔ)水定容至1L.用前冰箱或冰上預(yù)冷.樣品制備鮮樣0.1-0.5g參加1ml磷酸緩沖液0.05M,pH7.8,稍許石英砂,研磨成勻漿；移入10ml離心管中,再用4ml磷酸緩沖液分兩次洗滌研缽并全部轉(zhuǎn)入離心管中；10000Xg4C下離心20mi

2、n;上清夜貯于4c冰箱中保存?zhèn)錅y(cè).同時(shí)稱取鮮樣一份0.1g左右烘干稱重.SOD入=560nm試劑配制：1LPBS緩沖液中參加Met1.93973gNBT氮藍(lán)四陛0.061323gEDTA-Na20.0037224g核更系0.00075272g實(shí)驗(yàn)步驟：2.725mL反響液+250uL蒸儲(chǔ)水+25uL酶液【樣品管】2.75mL反響液+250uL蒸儲(chǔ)水光照作為100%CK1照光對(duì)照管】2.75mL反響液+250uL蒸儲(chǔ)水黑暗作為調(diào)零【空白調(diào)零管】4000lx日光燈下反響20分鐘,560nm比色.反響溫度2535C.SODM生單位以抑制NBT光化復(fù)原的50%為一個(gè)酶活性單位表示按下式計(jì)算SODM生：

3、SOD總活性=Ack-AE*V/0.5*Ack*w*Vt式中SOD總活性以鮮重酶單位每克表示,Ack為照光對(duì)照管的吸光度,AE為樣品管的吸光度,V為樣品液的總體積ml,Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量ml,w為樣品鮮重g【空白調(diào)零管】可在光反響快結(jié)束前配制并用黑色紙或鋁箔包裹以避光.【樣品管】和【照光對(duì)照管】在光反響快結(jié)束后至測(cè)定前應(yīng)避光處理.POD入=470nm比色試劑配制：1.5%愈創(chuàng)木酚1.5ml愈創(chuàng)木酚,用蒸儲(chǔ)水定容到100ml300uM的H2O2取30%的H2O21.53ml,用蒸儲(chǔ)水定容到50ml;實(shí)驗(yàn)步驟：100ul酶液+2700ulPBS+100ul愈創(chuàng)木酚+100ulH2O2于普通比色皿

4、,輕輕搖勻2-秒,A470動(dòng)力學(xué)測(cè)定1分鐘.選擇時(shí)間段較為筆直的曲線斜率為activity,此后測(cè)定均參考該時(shí)間段.結(jié)果計(jì)算：PODmmol/g尸activityxAxVxa/ExwA反響液總體積/ml;V提取液總體積/ml;a測(cè)定液體積/ml;w材料鮮重/g;E吸光系數(shù)/mM-cm-1CAT240nm比色試劑配制：300uM的H2O2取30%的H2O21.53ml,用蒸儲(chǔ)水定容到50ml;實(shí)驗(yàn)步驟：100ul酶液+2800ulPBS+100ulH2O2,于石英比色皿,輕輕搖勻2-秒,A240動(dòng)力學(xué)測(cè)定1分鐘.選擇時(shí)間段較為筆直的曲線斜率為activity,此后測(cè)定均參考該時(shí)間段.結(jié)果計(jì)算：C

5、ATmmol/g尸activityXAXVxa/ExwAPX入=290nm比色試劑配制：7.5mM的抗壞血酸AsA:66mgAsA用蒸儲(chǔ)水定容到50ml;300uM的H2O2取30%的H2O21.53ml,用蒸儲(chǔ)水定容到50ml;實(shí)驗(yàn)步驟：100ul酶液+2700ulPBS+100ulAsA+100ulH2O2,于石英比色皿,輕輕搖勻2-秒,A290動(dòng)力學(xué)測(cè)定1分鐘.選擇時(shí)間段較為筆直的曲線斜率為activity,此后測(cè)定均參考該時(shí)間段.結(jié)果計(jì)算：CATmmol/g尸activityXAXVxa/ExwB.丙二醛MDA含量的測(cè)定入=450,532,600nm比色試劑配制：5獷氯乙酸TCA:25

6、g三氯乙酸定容到500mLMDA反響液：2.5g硫代巴比妥酸,先用少量1M的氫氧化鈉溶解,再用5獷氯乙酸定容到500mL實(shí)驗(yàn)步驟：0.5mL酶液+2.5mL反響液,沸水浴反響15分鐘,立即冰浴,4800rpm離心10分鐘,上清轉(zhuǎn)入新管,波長(zhǎng)450,532和600下比色,MD順應(yīng)液調(diào)零.結(jié)果計(jì)算：丙二醛含量nmol.g-1=D532D600*A*V/a*1.55*10-1*w式中A為反響液總量 mD;V為提取液總量 mL ;a為測(cè)量用提取液量 mL ;w為材料鮮重 g.1.55X10-1為丙二醛的umol/L消光系數(shù)nmol/mL消光系數(shù)或者：MD除度umol/L=6.45D532D6000.5

7、6D450丙二醛含量umol.g-1=MDA濃度X提取液總體積ml/組織鮮重g/1000植物體可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定比色原理：染料考馬斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色,當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?前者最大光吸收在465nm,后者在595ns在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)0100g/ml,蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比.故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定.蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)到達(dá)平衡,完成反響十分迅速,其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定.該反響非常靈敏,可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量,所以是一種比擬好的蛋白質(zhì)定量法.【試劑】1、65mmol/L磷酸鉀緩沖液p

8、H7.8;如超氧陰離子自由基含量測(cè)定用.稱取K2HPO43H2OMW=228.229.1234g和KH2PO4MW=136.093.406g,蒸儲(chǔ)水定容至U1L.或K2HPO43H2O4.562g和KH2PO41.703g,蒸儲(chǔ)水定容至U0.5L.2、考馬斯亮藍(lán)G-250:稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml90叱醇中,參加85%W/V磷酸100ml,最后用蒸儲(chǔ)水定容至1000mlo濾紙過(guò)濾后低溫儲(chǔ)存.常溫下可放置一個(gè)月；3、磷酸85%W/V:也即商業(yè)磷酸濃度85%.直接用.4、0.15M的NaCl標(biāo)準(zhǔn)曲線用：NaCl0.8766g蒸儲(chǔ)水定容到100ml.【方法】【方法】1.標(biāo)準(zhǔn)曲線

9、的繪制血清白蛋白BSA先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液.表1配制01000dg/ml血清白蛋白液123456牛血清蛋白原液ml00.10.20.30.40.5磷酸鉀緩沖液量ml1.00.90.80.70.60.5蛋白質(zhì)含量g/ml02004006008001000以上各管混勻后,各取0.1ml于新的10ml離心管內(nèi),各加5ml考馬斯亮藍(lán)染液,混勻放置2min,在595nm下比色,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.折衷：表2配制01000dg/ml血清白蛋白液-123456牛血清蛋白原液ul01020304050磷酸鉀緩沖液量ul1009080706050蛋白質(zhì)含量g/ml0200400600800

10、1000以上各管混勻后,各加5ml考馬斯亮藍(lán)染液,曲線.2.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定混勻放置2min,在595nm下比色, 繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品制備參見(jiàn)超氧陰離子自由基含量測(cè)定方案.各加5ml考馬斯鳧藍(lán)染液,混勻放置2min,3.結(jié)果計(jì)算取樣品上清液在595nm下比色.0.1ml于新的10ml離心管內(nèi),式中C查林軸喇嘛!銜由童儂魯iff=CgVW;V提取液總積 ml ;此為樣品提取液總體積為3ml;W取樣量g.X測(cè)定以上3工程時(shí),同時(shí)取局部同批剩余鮮樣稱重后轉(zhuǎn)入紙袋烘干稱重.2.可溶蛋白、超氧陰離子自由基_植物材料0.1-0.2g左右記錄準(zhǔn)確稱量值65mmol/L磷酸鉀緩沖液pH7.81ml一少許

11、石英砂一冰上充分研磨一轉(zhuǎn)入離心管一磷酸鉀緩沖液洗滌研缽2次,每次1ml全部轉(zhuǎn)入離心管樣品提取液總體積為3ml-4c10000r/min離心15min一取上清液轉(zhuǎn)入新管標(biāo)記低溫保存待測(cè)液.A.超氧陰離子自由基入=530nm比色原理：2Q.-+鹽酸羥胺一NQ-+磺胺一重氮化磺胺+一泰胺一偶氮化合物粉紅色,在波長(zhǎng)530nm處有顯著的光吸收試劑準(zhǔn)備：1、65mmol/L磷酸鉀緩沖液pH7.8;【不用磷酸鈉】稱取&HPO-3H2OMW=228.229.1234g和KH2PO4MW=136.093.406g,蒸儲(chǔ)水定容到1L.或KHPO-3H2.4.562g和KHPO1.703g,蒸儲(chǔ)水定容到0.

12、5L.2、10mmol/L鹽酸羥胺；稱取鹽酸羥胺MW=69.490.06949g蒸儲(chǔ)水定容到100mL3、12mol/L乙酸：稱取冰乙酸MW=60.05144.1g蒸儲(chǔ)水定容到200mL4、58mmol/L磺胺12mol/L乙酸為溶劑配制;稱取磺胺MW=172.210.9988g,用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL5、7mmol/L-泰胺12mol/L乙酸為溶劑配制；稱取a-蔡胺MW=143.190.100233g0.1g,用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL6、三氯甲烷氯仿；7、NaNO230umol/LNaNO2用65mmol/L磷酸鉀緩沖液配制和稀釋：稱取NaNO2MW=6

13、9.000.207g用65mmol/L磷酸鉀緩沖?定容到1L此時(shí)NaNO2濃度3mM從中吸取5ul,加65mmol/L磷酸鉀緩沖液495ul即可30uM.其它25,20,15,10,5umol/LNaNO2,依此.測(cè)定流程圖空白調(diào)零組：磷酸鉀緩沖液0.5ml一鹽酸羥胺0.1ml一搖勻一25c水浴10min一冰浴一磷酸鉀緩沖液0.5ml一搖勻一25c水浴20min一冰浴一磺胺1ml-“-泰胺1ml一搖勻一25c水浴20min一冰浴一三氯甲烷3ml-4c10000r/min離心3min一上層水相測(cè)定A530.試驗(yàn)組：磷酸鉀緩沖液0.5ml一鹽酸羥胺0.1ml一搖勻一25c水浴10min一冰浴一上清

14、液0.5ml一搖勻一25c水浴20min一冰浴一磺胺1ml一“-蔡月堂1ml一搖勻一25c水浴20min一冰浴一三氯甲烷3ml-4c10000r/min離心3min一粉紅色水相上層測(cè)定A530.標(biāo)準(zhǔn)曲線：NaNO2i65mmol/L磷酸鉀緩沖全彼配置成30umol/L,再稀釋成25,20,15,10,5和0umol/L.磷酸鉀緩沖液0.5ml一鹽酸羥胺0.1ml一搖勻一25c水浴10min一冰浴一加各種不同濃度的NaNO2各取0.5ml一搖勻一25c水浴20min一冰浴一磺胺1ml-“-泰胺1ml一搖勻一25c水浴20min一冰浴一三氯甲烷3ml一10000r/min離心3min一粉紅色水相上

15、層測(cè)定A530.結(jié)果計(jì)算：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線生成的NO2與A530的方程,求出NO2-,乘2那么得O2.-.O2.-產(chǎn)生速率=O2.-/樣品Pr含量/20min;O2.-產(chǎn)生總量=O2.-/樣品Pr含量25c水浴共培養(yǎng)60min.說(shuō)明：鮮樣測(cè)定,不能用于干樣品,樣品也不宜液氮速凍后超低溫冰箱儲(chǔ)存后測(cè)定.鹽酸羥胺與樣品上清液的25c水浴共培養(yǎng)20min用于O2.-產(chǎn)生速率測(cè)定；如果25c水浴共培養(yǎng)60min那么用于O2.-含量測(cè)定.25c水浴共培養(yǎng)的時(shí)間為關(guān)鍵時(shí)間,必須掌握好,此步處理前后樣品試劑溶液盡量處于冰浴狀態(tài).待測(cè)液制備后應(yīng)盡快測(cè)定.干旱脅迫處理,要同時(shí)稱量所取用的同一樣品烘干至恒重稱出烘干重

16、,以便計(jì)算單位干重樣品的O2.-產(chǎn)生速率； 或者用的同一新鮮樣品測(cè)定蛋白質(zhì)含量,以便計(jì)算單位蛋白質(zhì)質(zhì)量的O2.-產(chǎn)生速率.B.可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定比色原理：染料考馬斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色,當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?前者最大光吸收在465nm,后者在595ns在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)0100g/ml,蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比.故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定.蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)到達(dá)平衡,完成反響十分迅速,其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定.該反響非常靈敏,可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量,所以是一種比擬好的蛋白質(zhì)定量法.【試劑】1

17、、65mmol/L磷酸鉀緩沖液pH7.8;如超氧陰離子自由基含量測(cè)定用.稱取K2HPO43H2OMW=228.229.1234g和KH2PO4MW=136.093.406g,蒸儲(chǔ)水定容至U1L.或K2HPO43H2O4.562g和KH2PO41.703g,蒸儲(chǔ)水定容至U0.5L.2、考馬斯亮藍(lán)G-250:稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml90叱醇中,參加85%W/V磷酸100ml,最后用蒸儲(chǔ)水定容至1000mlo濾紙過(guò)濾后低溫儲(chǔ)存.常溫下可放置一個(gè)月；3、磷酸85%W/V:也即商業(yè)磷酸濃度85%.直接用.4、0.15M的NaCl標(biāo)準(zhǔn)曲線用：NaCl0.8766g蒸儲(chǔ)水定容到100m

18、l.【方法】【方法】1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制血清白蛋白BSA先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液.表1配制01000Pg/ml血清白蛋白液123456牛血清蛋白原液ml00.10.20.30.40.5磷酸鉀緩沖液量ml1.00.90.80.70.60.5蛋白質(zhì)含量g/ml02004006008001000以上各管混勻后,各取0.1ml于新的10ml離心管內(nèi),2min,在595nm下比色,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.折衷：表2配制01000dg/ml血清白蛋白液各加5ml考馬斯鳧藍(lán)染液,混勻放置123456牛血清蛋白原液ul01020304050磷酸鉀緩沖液量ul1009080706050蛋白質(zhì)含量g/

19、ml02004006008001000以上各管混勻后,各加5ml考馬斯鳧藍(lán)染液,混勻放置2min,595nm繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.2.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定樣品制備參見(jiàn)超氧陰離子自由基含量測(cè)定方案.取樣品上清液0.1ml于新的10ml離心管內(nèi),各加5ml考馬斯亮藍(lán)染液,混勻放置2min,在595nm下比色.3.結(jié)果計(jì)算式中C查械貓喇岬際瘠fiOTg/t爵由)=CgVW;V提取液總積(ml);此為樣品提取液總體積為3ml;W取樣量(g).X測(cè)定以上3工程時(shí),同時(shí)取局部同批剩余鮮樣稱重后轉(zhuǎn)入紙袋烘干稱重.3.葉綠素、類胡蘿卜素葉綠素、類胡蘿卜素測(cè)量實(shí)驗(yàn)步驟：葉片快速剪取并精確稱重0.1g左右,重復(fù)3

20、次.再快速剪成細(xì)絲(或用打孔器打成小的葉圓片)轉(zhuǎn)入潔凈離心管,管內(nèi)加提取液10ml,于室溫下遮光靜置至樣品完全發(fā)白(期間屢次搖動(dòng)提取液),對(duì)提取液比色(以不加葉片的提取液調(diào)零),然后據(jù)提取液類型按下面公式計(jì)算葉綠素和類胡卜素含量.剪取葉片同時(shí)再精確稱取0.1-0.2g左右葉片,1050c殺青10min,80oC烘干恒重后稱重.結(jié)果計(jì)算：一、采用丙酮、無(wú)水乙醇、蒸儲(chǔ)水混合提取液(三者體積比4.5:4.5：1)Chla(mg/L尸9.784OD6630.990OD645,Chlb(mg/L尸21.426OD6454.650OD663,Chl(a+b)(mg/L)=5.134OD663+20.436

21、OD645,Car(mg/L)=4.695OD4400.268(Chla+Chlb),采用波長(zhǎng)663,645和440nmo唐延林,黃敬峰,王人潮.水稻不同發(fā)育時(shí)期高光譜與葉綠素和類胡蘿卜素的變化規(guī)律.中國(guó)水稻科學(xué)2004,18(1)59-66二、采用80斷酮提取液采用波長(zhǎng)663,646和470ns(ArnonandLichtenthale)Chla(mg/L)=12.21D663-2.81D646;Chlb(mg/L)=20.13D646-5.03D663;Chl(a+b)(mg/L)=Chla+Chlb=17.32D645+7.18D663;Car(mg/L)=(1000D470-3.27C

22、hla-104Chlb)/229三、采用采用95叱醇提取液-采用波長(zhǎng)665,649和470ns(鄒琦等)Chla(mg/L)=13.95D665-6.88D649;Chlb(mg/L)=24.96D649-7.32D665;Chl(a+b)(mg/L)=Chla+Chlb=18.08D645+6.63D663;Car(mg/L)=(1000D470-2.05Chla-114.8Chlb)/245結(jié)果：Chl(mg/g)=濃度(mg/L)x提取液體積(ml)/質(zhì)量(g)x10004.可溶性糖意酮法測(cè)定可溶性糖樣品制備測(cè)定：取新鮮植物葉片(或干材料),擦凈外表污物,剪碎混勻,精確稱取0.05-0.

23、1g左右,轉(zhuǎn)入研缽,加少許石英砂,1ml蒸儲(chǔ)水充分研磨后轉(zhuǎn)入10ml離心管,4ml蒸儲(chǔ)水分次洗滌研缽后也完全轉(zhuǎn)入離心管內(nèi).離心管沸水浴30min,5000rpm離心5min,上清轉(zhuǎn)入新管,原來(lái)離心管殘?jiān)偌铀?ml,混勻后沸水浴10min,5000rpm離心5min,上清一并轉(zhuǎn)入新管,并蒸儲(chǔ)水定容到10ml混勻備測(cè).【原理】糖在濃硫酸作用下,可經(jīng)脫水反響生成糠醛或羥甲基糠醛,生成的糠醛或羥甲基糠醛可與慈酮反響生成藍(lán)綠色糠醛衍生物,在一定范圍內(nèi),顏色深淺與糖含量成正比.用意酮法測(cè)出的碳水化合物含量,實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量.【試劑】1 .慈酮乙酸乙酯試劑：取分析純慈酮1g,溶于50

24、ml乙酸乙酯中,貯于棕色瓶中,在黑暗中可保存數(shù)星期,如有結(jié)晶析出,可微熱溶解.2 .濃硫酸(比重1.84).標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：100g/ml蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：將分析純蔗糖在80c下烘至恒重,精確稱取1.000g.加少量水溶解,移入100ml容量瓶中,參加0.5ml濃硫酸,用蒸儲(chǔ)水定容至刻度；精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml參加100ml容量瓶中,加水定容.表各試管加溶液和水的量管號(hào)012345678910100g/ml蔗糖液(ul)04080120160200水(ul)400360320280P240200此時(shí)蔗糖濃度科g/ml01020304050取10ml離心管11支,從010分別編號(hào),根據(jù)上表參加蔗糖

25、標(biāo)準(zhǔn)液和水后,逐管參加意酮乙酸乙酯試劑0.1ml并小心參加濃硫酸1ml,加蓋后充分震蕩,立即沸水浴1min,取出冷卻后630nm比色,蒸儲(chǔ)水調(diào)零.上清液0.2ml加蒸儲(chǔ)水0.2ml,參加慈酮乙酸乙酯試劑0.1ml并小心參加濃硫酸1ml,加蓋后充分震蕩,立即沸水浴1min,取出冷卻后630nm比色,蒸儲(chǔ)水調(diào)零.結(jié)果計(jì)算：可溶糖含量mg/gFWorDW=C*V/W/1000C：標(biāo)曲所得可溶糖含量ug/ml;V:樣品提取液體積10ml;W樣品鮮重或干重g.5.游離氨基酸游離氨基酸含量測(cè)定樣品制備測(cè)定：葉片準(zhǔn)確稱取0.05-0.1g于研缽,1ml的10叱酸重復(fù)研磨,轉(zhuǎn)入10ml潔凈離心管,2ml的10

26、叱酸分兩次洗滌研缽并完全轉(zhuǎn)入離心管內(nèi),加無(wú)氨蒸儲(chǔ)水可以超純水替代定容到10ml離心管口位置,搖勻后5000rpm離心10min,上清液轉(zhuǎn)入新管備測(cè).同時(shí)取局部同批剩余鮮樣稱重后轉(zhuǎn)入紙袋烘干稱重.試劑配制：1、醋酸鈉-醋酸緩沖液pH=4.9:9.679g的醋酸鈉CH3COON由口4.924g的醋酸CH3COOH蒸儲(chǔ)水定容到100ml.2、苛三酮緩沖顯色液1%:1.05g苛三酮+18ml正丙醇+25ml正丁醇+50ml乙二醇+12ml醋酸鈉-醋酸緩沖液.3、ASA抗壞血酸0.1%:50mg的ASA溶于50ml的無(wú)氨蒸儲(chǔ)水可以超純水替代.現(xiàn)用現(xiàn)4、10叱酸：10ml冰乙酸加90ml蒸儲(chǔ)水.5、80叱

27、醇：850ml的95%勺乙醇可以組培間大桶酒精替代力口150ml蒸儲(chǔ)水.6、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0ug/ml:烘干恒重的谷氨酸0.0536g,先用少量的10%勺異丙醇0.5ml異丙醇加4.5ml蒸儲(chǔ)水混勻溶解后,轉(zhuǎn)入100ml潔凈容量瓶,用蒸儲(chǔ)水定容至刻度.從中取5ml用水稀釋到50ml即可.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：試齊一一離心唯字號(hào)p2回456氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液ul04080120160200無(wú)氨蒸溜水ul20016012080400前二酮緩沖顯色液ul700700700700700700抗壞血酸ul202020202020氨基酸含量ug/ml012345根據(jù)上表依次參加各試劑,搖勻后,沸水浴顯色20min

28、,取出后迅速冰浴,并不時(shí)搖動(dòng)離心管,當(dāng)溶液呈藍(lán)紫色時(shí)各加80叱酉I2ml和蒸儲(chǔ)水2.08ml,搖勻后,570nm比色繪制標(biāo)曲.上清液200ul參加到10ml離心管內(nèi)一加苛三酮緩沖顯色液700ul0.1%抗壞血酸20ul一沸水浴顯色20min一迅速冰浴一溶液呈藍(lán)紫色時(shí)一加80叱酉12ml一蒸儲(chǔ)水2.08ml570nm比結(jié)果計(jì)算：AA含量mg/gFWorDW=C*V/W/1000C：標(biāo)曲所得AA含量ug/ml;V:樣品提取液體積10ml;W樣品鮮重或干重g.6.過(guò)氧化氫植物組織中過(guò)氧化氫含量測(cè)定入=415nm樣品提取和測(cè)定：1稱取新鮮植物組織0.2g左右視H2O2含量多少而定,參加4c下預(yù)冷的丙酮

29、1ml和少許石英砂研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管,再用2-3ml冷丙酮分次洗滌研缽并把洗滌液轉(zhuǎn)入離心管,3000r/min下離心10min或8000rpm離心5min,同時(shí)準(zhǔn)備新的離心管并編號(hào)標(biāo)記并稱重記錄,離心完以后,上清液轉(zhuǎn)入新離心管后,再次稱重,兩次稱重差值除以丙酮密度0.792g/ml,即為樣品提取液總體積.【原理】H2O2與硫酸鈦或氯化鈦生成過(guò)氧化物一鈦復(fù)合物黃色沉淀,可被H2SO4溶解后,在415nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定.在一定范圍內(nèi),其顏色深淺與H2O凝度呈線性關(guān)系.【試劑】1、100mol/LH2O2丙酮試劑：取30附析純H2O210.2口,溶于100ml的丙酮此時(shí)H2O2為1mmol/L,

30、混勻后從中吸取506再加丙酮4506混勻 此時(shí)H2O2為100科mol/L.2、1mol/L硫酸： 濃硫酸56ml,緩慢加蒸儲(chǔ)水944ml,混勻冷卻.3、5%W/V硫酸鈦：稱取5g硫酸鈦,加蒸儲(chǔ)水100ml溶解.4、丙酮冰浴或冰箱預(yù)冷；5、濃氨水.【方法】【方法】1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取10ml離心管7支,順序編號(hào),并按表1和2參加試劑.表1測(cè)定H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線配置表試齊J(ml)離心管號(hào)12345167100科mol/LH2O200.10.20.40.60.81.04C卜預(yù)冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%1酸鈦0.10.10.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.2

31、0.20.20.20.23000r/min離心10min,棄去上清夜,留沉淀1mol/L硫酸5.05.05.05.05.05.05.0表2測(cè)定H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線配置表試齊J(ml)離心管號(hào)12345671mmol/LH2O200.10.20.40.60.81.04C卜預(yù)冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%|酸鈦0.10.10.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min離心10min,棄去上清夜,留沉淀1mol/L硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后,將其小心轉(zhuǎn)入新的10ml離心管中,并用蒸儲(chǔ)水少量屢次沖洗

32、原來(lái)的離心管,將洗滌液合并后定容至10ml刻度,415nm波長(zhǎng)下比色.2.2用移液管吸取樣品提取液1ml,按表1或2參加5%1酸鈦0.1ml和濃氨水0.2ml,待沉淀形成后3000rpm/min離心10min或8000rpm離心5min,棄去上清液.沉淀用冷丙酮反復(fù)洗滌35次,每次1ml具體為：沉淀加冷丙酮1ml,混勻,8000rpm離心1min,棄掉丙酮；重復(fù)此步驟三次,直到去除植物色素.3向洗滌后的沉淀中參加1mol/L硫酸5ml,搖勻,待完全溶解后,與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色.3.結(jié)果計(jì)算：植物組織中H2O2含量mol/gFw尸F(xiàn)WV1式中C一標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中H2O2濃度Wmol

33、;Vt一樣品提取液總體積ml;V1測(cè)定時(shí)用樣品提取液體積ml;即1ml.FW一植物組織鮮重g.7.谷胱甘肽、ASAA.谷胱甘肽含量的測(cè)定復(fù)原型谷胱甘肽GSH是植物細(xì)胞內(nèi)另一種重要的抗氧化劑.它含有活性的萌基,極易被氧化.本實(shí)驗(yàn)利用疏基試劑DTN創(chuàng)U定GSH的含量.試劑藥品：GSH勺提取下面的ASA測(cè)定也使用該提取液精確稱0.2g左右葉片,將樣品剪碎參加5mL10%三氯乙酸,研磨,15000Xg離心10min,留取上清液備測(cè).同時(shí)再精確稱取0.2g左右葉片,1050c殺青10min,80oC烘干恒重后稱重.1、10%三氯乙酸TCA溶?夜W/V:10g三氯乙酸,用蒸儲(chǔ)水配成100mL溶液；2、15

34、0mM磷酸緩沖液pH7.5;含有5mMEDTA:Na2HPO412H2c38.679g和NaH2P042H2O3.952g溶于約1L水；參加EDTA#其濃度為5mM攪勻后蒸儲(chǔ)水定容.3、6mMDTNB上面的150mMNaH2PO4pH7.5;含有5mMEDTA配制實(shí)驗(yàn)步驟：1、GSHB推曲線的制作配制濃度分別為0mM0.02mM、0.04mM0.06mM、0.08mM、0.10mM0.12mM的標(biāo)淮GSH液,吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液各0.25mL.分別參加150mMNaH2P04pH7.42.60mL,混合均勾后,往各管中加人DTNB式劑0.15mL,搖勻厲,30c保溫反響5min,測(cè)A412nm以加磷酸緩沖?代替DTNB式齊IJ作空白對(duì)照.將測(cè)定結(jié)果以GSHB度為橫坐標(biāo)、光密度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)淮曲線.2、GSH的提取下面的ASA測(cè)定也使用該提取液精確稱0.2g左右葉片,將樣品剪碎參加5mL10%三氯乙酸,研磨,15000Xg離心10min,留取上清液備測(cè).同時(shí)再精確稱取0.2g左右葉片,1050c殺青10min,80