1、精選優質文檔-傾情為你奉上聚合酶鏈式反應（PCR）原理DNA的半保留復制時，雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗條件下，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。PCR類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性 - 退火(復性）- 延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94左右一定時間后，使模板D

2、NA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至4060左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板 - 引物結合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR技術分類（常用）（1）反向PCR技術(Inve

3、rse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁側序列的一種方法主要原理是用一種在已知序列中無切點的限制性內切酶消化基因組DNA后酶切片段自身環化以環化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結合的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內切酶在已知基閑側翼DNA序列內部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段 。（2）錨定PCR技術(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反轉錄cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列為引物結合位點對該cDNA進行擴增

4、, 稱為APCR。（3）不對稱PCR技術(asymmetric PCR)：兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術稱不對稱PCR。在擴增循環中引入不同的引物濃度, 常用50100÷1比例。在最初的1015個循環中主要產物還是雙鏈DNA, 但當低濃度引物被消耗盡后, 高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量單鏈DNA。（4）反轉錄PCR技術(reverse transcription PCR, RT-PCR)：當擴增模板為RNA時, 需先通過反轉錄酶將其反轉錄為cDNA才能進行擴增。應用非常廣泛, 無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經常采用。（5）巢式PCR技術(NEST-PCR)：先用一對靶

5、序列的外引物擴增以提高模板量, 然后再用一對內引物擴增以得到特異的PCR帶, 此為巢式PCR。若用一條外引物作內引物則稱之為半巢式PCR。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設計得比內引物長些, 且用量較少, 同時在第一次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度, 這樣在第一次PCR時, 由于較高退火溫度下內引物不能與模板結合, 故只有外引物擴增產物, 經過若干次循環, 待外引物基本消耗盡, 無需取出第一次PCR產物, 只需降低退火即可直接進行PCR擴增。這不僅減少操作步驟, 同時也降低了交叉污染的機會。這種PCR稱中途進退式PCR，主要用于極少量DNA模板的擴增。（6）多重PCR

6、技術(multiplex PCR)：在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段,如果基因的某一區段有缺失,則相應的電泳譜上這一區帶就會消失。主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。（7）重組PCR技術：重組PCR技術是在兩個PCR擴增體系中, 兩對引物分別由其中之一在其5-端和3-端引物上帶上一段互補的序列,混合兩種PCR擴增產物,經變性和復性,兩組PCR產物互補序列發生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR 條件下發生聚合延伸反應,產生一個包含兩個不同基因的雜合基因。（8）原位PCR技術：利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段,在不破壞細胞的前

7、提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增，可進行細胞內定位，適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。（9）熒光定量實時PCR技術反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升，最終DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算，Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平均每次的擴增效率，n表示循環次數。平均擴增效率理論值為100%，但實際情況達不到，反應初期靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，此效應稱平臺期，與DNA聚合酶

8、數量和活性、PCR擴增效率、非特異性產物的競爭等因素有關。PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分，短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短、長產物片段是由于引物所結合的模板不同而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是長產物片段。進入第二個反應周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈（長產物片段）結合引物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，故這次延伸的片段3端被固定了止點，保證了新片段的起點、止點都限定于引物擴增的序列以內

9、，形成長短一致的短產物片段。由于短產物片段是按指數倍數增加，而長產物片段則以算術倍數增加，故可忽略不計，使得PCR的反應產物不需再純化既可以保證足夠純的DNA片段供分析、監測。反應五要素 - 引物、模板、DNA聚合酶、四種dNTP、Mg2+（1）引物設計 ？引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，引物自身連續互補堿基不能超過3個，一對引物間也不易多于四個連續堿基的互補性。 【引物的GC含量和Tm值

10、應該協調：Tm=4（G+C）+2（A+T）】避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。 引物3端為關鍵堿基，是PCR延伸的起始端，不能進行任何修飾，也不能形成二級結構的可能，一般3端也不能發生錯配，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。 5端無嚴格限制，只起限定PCR產物長度的作用，對擴增特異性影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物

11、量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。（2）DNA聚合酶：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量0.5-2.5 U/50 ml，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。 （3）dNTP的質量與濃度：dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其PH調節到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會使dNTP

12、降解。在PCR反應中，dNTP應為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。 （4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙

13、醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。（5）Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。RT-PCR - 是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。總RNA提取（-70保存）Trizol法：1、取組織100于玻璃勻漿器中，加入1ml Trizol 冰上抽打勻漿（邊勻漿邊暫停）2、移入1.5mlEP管中，顛倒混勻，室溫保存

14、5min3、加氯仿0.2ml（總體積的1/5），振蕩混合，室溫放置5min4、4，離心12000 rpm，15min 5、取上層液相（約400l）移入一新1.5ml EP管中，加等體積異丙醇（約400l）,振蕩混合，室溫保存10min6、4，離心12000 rpm，10min7、棄上清液，加1ml 75%無水乙醇（4保存），振蕩混合8、4，離心7500 rpm，5min9、棄上清液，室溫放置20min(EP管倒置在濾紙上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（ 可保存在液氮或低溫冰箱-70）測RN

15、A濃度：走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值調零：750ul DEPC水測量：745ul DEPC水 + 5ul RNA總RNA濃度= OD260×40×稀釋倍數（150倍）ug/ml = OD260×40×150 ug/ml = OD260×6 ug/ulA1/A2應在1.8-2.0之間注意：提取RNA的質量主要是要通過260/280的比值看是不是在2.0左右，當OD260/OD280<1.8時提示有蛋白或酚的污染，需要進一步純化RNA；還要跑膠看看28s、18s、5s的三條帶是不是清晰，一般質

16、量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一條5s的應該比較淡。逆轉錄RT（cDNA：一周內-20保存，長期-70保存）RT反應體系：20ul體系第一步：約20分鐘RNA抽提物 5lRadome引物 2lRNAsin 0.5l1、65 15分鐘 2、立即放入冰浴 第二步：約2小時RNAsin 0.5l10mM dNTP 1l5× RT緩沖液 4l25mM MgCl2 4l AMV 3l1、37 1.5小時 2、94 5-10分鐘 3、反應物保存于-20或進行PCR聚合酶鏈反應PCR(產物-20保存)PCR反應體系：100l體系 約4.5小時 約5小時25mM MgCl2

17、 2l 3l10×PCR緩沖液 5l 5l10mM dNTP 1l 1l10pmol/l上游引物 2.5l 2.5l10pmol/l下游引物 2.5l 2.5lcDNA模板 2.5l 5lddH2O 34l 30lTaq酶 0.5l 1l輕質石蠟油 50l 50l1、94 2分鐘，55 1分鐘，72 2分鐘 為第一個步1個循環 2、94 45秒，55 40秒，72 1分鐘 為第二步30/40個循環 3、72 10分鐘 4、取出后4保存，5分鐘后-20保存或走電泳 瓊脂糖凝膠電泳：約1.25小時1、配制0.5× TBE電泳緩沖液300 ml 2、配制凝膠濃度1.7%（40ml

18、 0.5×TBE加0.68g膠），微波爐中火2分鐘溶解膠，冷卻至60加入溴乙錠2l（10mg/ml的終濃度0.5g/ml），充分混勻3、將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現進行電泳4、加樣8l PCR反應產物+2l溴酚蘭 ，空一格加DNA marker5、電泳50-80V ，電場強度不宜高于5V/cm6、在紫外燈下觀察,DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系 統拍照保存。電泳緩沖液(5×TBE貯存液)：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用時，將5×TBE稀釋10倍成0.5×TBE就可以在電泳時使用(工作濃度)。上樣緩沖液(6×緩沖液，4保存)：0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青FF、30%甘油瓊脂糖凝膠配制：（1.0%）1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐加熱至沸騰(如果首次煮膠，一定要煮透，以不出現泡沫為標志)，熔化的瓊脂物冷卻至60時加入10mg/ml溴化乙錠5l，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快瓊