1、木瓜中多糖的提取、分離與鑒定摘要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、復合提取法從木瓜中提取多糖，通過度離純化后，進行瓜鑒定。為木瓜多糖的工業化生產提供了必然的理論依據。關鍵詞：木瓜；多糖；提取；分離；鑒定0前言多糖(polysacharides,PS),又稱多聚糖，是一種具有普遍生物活性的大分子。從各類中草藥和其他植物中都能夠提取分離出多糖，我國最近幾年來對植物多糖，專門是具有中國特色的中草藥多糖的藥物活性已有普遍報導。木瓜原名番木瓜，始載于名醫別錄，屬薔薇科木瓜屬植物，是我國特有果木之一，要緊生長在亞熱帶溫暖濕潤的山區地帶，是一種藥食同源的植物，性溫味酸。現代醫學證明：木水果實中含

2、有豐碩的糖分、番木瓜堿、木瓜蛋白酶，并含有17種以上的氨基酸及多種微量元素。目前已有大量木瓜產品上市，如木瓜飲料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜脯等，深受人們的喜愛。湖北建始縣盛產木瓜，可是創收的途徑主若是通過銷售鮮木瓜或干木瓜，其他相關產品的開發并非多見。從木瓜中提取和分離鑒定具有保健和藥理活性的功能性成份，關于提高木瓜的經濟價值，解決目前農人木瓜豐收不豐收、大量木瓜急待加工開發的問題具有踴躍的意義。本實驗對木瓜中多糖進行研究，擬對其提取工藝進行優化，并對粗多糖進行分離純化鑒定組成和結構進行初步表征，為進一步提高木瓜的附加值提供實驗依據。1材料與方式材料(1)原料：湖北省建始縣干木瓜

3、片，粉碎機粉碎(2)儀器：TDL-5-A臺式離心機，UV-7504紫外-可見分光光度計，SHZ-III型循環水真空泵，紫外掃描儀，付立葉變換紅外光譜儀，Prostar高效液相色譜儀等。(3)試劑：石油酸(沸程60-90),丙酮，乙醇(95%),戊醇，三氯甲烷，氯化鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，硫酸，鹽酸，苯酚，葡萄糖，乙醐，三氟三氯乙烷，三氯醋酸，碘液，硫酸銅，酒石酸鉀鈉，D-半乳糖，漠化鉀，碳酸鋼。1.2方式(1)多糖的測定：用苯酚-硫酸法對多糖測定。(2)多糖的提取：不同提取多糖方式的比較。別離用索氏抽提法，水提醇沉法，乙醇回流提取法，復合提取法提取木瓜中的多糖，并比較多糖得率，選擇較好的水

4、提醇沉法進行優化處置。水提醇沉法提取多糖工藝的優化單因素實驗a溫度對提取率的阻礙：加水量為30ml,水提時刻為30分鐘,別離在75、80>85、90>95的水浴條件下,提取多糖,用苯酚-硫酸法測定其含量，b加水量對提取率的阻礙：水浴溫度為90,水提時刻為30分鐘的條件下，改變加水量，提取多糖，并采納苯酚-硫酸法進行測定，c水提時刻對提取率的阻礙：水浴溫度為90,加水量為40ml的條件下，不同的水提時刻對多糖得率的阻礙，正交實驗依照單因素實驗的結果，選取適合的水平，對其進行優化處置。（3）多糖的分離、純化。蛋白質的去除：別離用Scvagc法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除樣品中的蛋白

5、質。低聚糖等小分子雜質的去除：通過逆向流水透析除去低聚糖等小分子雜質。多糖的柱層析純化：采納DEAE-52纖維素離子互換柱柱層析方式進行。依次用/L的NaOH、HC1和蒸僧水處置填柱材料至中性,反復處置三次后用蒸僧水洗至中性，抽氣裝柱。用pH=溶液平穩48小時。稱取粗多糖，溶于少量蒸僧水中，離心除去不溶物，上清液過柱。用的NaCl-PBS溶液梯度洗脫，操縱流速為Iml/min,采納部份搜集器按5ml/tub搜集。以苯酚-硫酸法測吸光值（490nm）作洗脫曲線，依照吸光值將同一組分歸并。（4）多糖的鑒定。淀粉的碘反映:將純化后的取得的多糖配制成5%的溶液,滴加碘液，水浴加熱，觀看顏色是不是有轉變

6、，同時做淀粉的對如實驗。溶解性：稱取純化后的多糖，加入3ml的水，常溫下攪拌,觀看其溶解性。還原糖的測定：取mg/ml的多糖溶液50ml于試管中，在80°C的恒溫水浴鍋中保溫30分鐘，吸取6ml,加入4ml的斐林試劑（等體積的斐林試劑A液和斐林試劑B液混合），于590nm處比色。蛋白質的測定：將純化取得的多糖在190-400nm處進行UV掃描，觀看在250-280nm處沒有吸收峰，判定是不是有核酸和蛋白質的存在。IR鑒定多糖中糖昔鍵的類型：將多糖與溟化鉀烘干后，稱取多糖2mg與100mg的溟化鉀研磨，壓片，置于紅外圖譜分析儀中作紅外分析。HPLC鑒定多糖中單糖的組成：用高效液相色譜法

7、對木瓜多糖的單糖組成進行定性鑒定。樣品的處置：稱取純化后的多糖，力口的硫酸2ml,充N2后于100水浴加熱5h,用BaC()3中和，膜過濾后作為待測樣品。標準液的配制：稱取葡萄糖、半乳糖25mg,別離溶于5ml的蒸儲水中，配成5mmL的標準液，膜過濾后待用。色譜條件：以AglientZorbaxCarbohydrateX25。mm,5um)糖分析柱為固定相，80%的乙睛為流動相，流速/min,柱溫25。利用示差檢測器進行檢測，進樣量為20uL,別離對葡萄糖和半乳糖標樣及樣品進行檢測。2結果與分析2.1標準曲線的成立本研究采納苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖為標準成立標準曲線，見圖2-1。由上

8、圖可知，回歸方程為y=+,R2=o線性關系較好，能夠以此來測定多糖的含量。2.2多糖的提取(1)不同提取多糖方式的比較。對四種提取法方式進行對照，由吸光值可得其相對得率，結果見圖2-2©圖2-2不同提取方式提取率的比較比較以上四種提取方式，本研究選定較好的水提醇沉淀法作為提取木瓜中多糖的方式，并在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗進行優化提取工藝。(2)單因素實驗。溫度對提取率的阻礙。由圖2-3能夠取得，在相同的加水量及水提時刻的條件下，在90時多糖的得率較高，提取成效較好，分析其緣故，能夠明白,升溫有利于粗多糖得率提高，為取得較高提取率，應選擇較高溫度，可是溫度超過9。時，不僅多糖的

9、生物活性有可能受到破壞，而且考慮到大幅度升溫會帶來能源消耗。綜合考慮效比，選擇85、90、95作為正交實驗的因素水平。加水量對提取率的阻礙。水浴溫度為90,水提時刻為30分鐘的條件下，改變加水量，提取多糖，并采納苯酚-硫酸法進行測定，結果見圖2-4。由圖2-4能夠取得，在相同水浴溫度及水提時刻的條件下，加水量為40ml時，多糖的得率相對較高，成效較好。在加水量為25ml或30ml時，由于水提的成效并非好，從而阻礙到醇沉成效，多糖的得率并非高，但加水過大，提取率反而下降，因此，加水量過少或過量均會造成多糖得率的降低。能夠選擇加水量3()ml>45ml、60ml作為正交實驗的三個水平。水提時

10、刻對提取率的阻礙。水浴溫度為90,加水量為40ml的條件下，不同的水提時刻對多糖得率的阻礙，結果見圖2-5。由圖2-5可知，水提時刻越長，粗多糖的得率越高，那時刻超過30分鐘時，提取率增加量開始減少，在40分鐘時，提取率最大,考慮到能源消耗、生產周期延長都會增加生產本錢，水提時刻不宜太長，因此選擇15min、20min、3()min作為正交實驗的三個水平。(3)正父結果。極差的大小反映出各因素對指標的阻礙程度，對多糖得率的阻礙因素的主次順序為水浴溫度>加水量>水提時刻。因素A的最正確水平為第二水平即水浴溫度9()時成效最好，因素B加水量以第二水平的45ml最正確，因

11、素C水提時刻以第二水平的20分鐘較好。因此，最優搭配為A2B2c2。按此工藝提取多糖其得率為。2.3多糖的分商、純化(1)蛋白質的去除。Scvagc法用氯仿等有機溶劑使蛋白質變性離心除去，該方式能避免多糖的降解，但除蛋白效率低，需重復多次才能除盡，同時會消耗大量的有機溶劑，并非適合于工業化大生產。三氟三氯乙烷法將多糖采納三氟三氯乙烷法除去蛋白，進行UV掃描結果能夠看出，此法脫蛋白的效率不高，而且溶液沸點較低，易揮發，不宜大量應用。三氯醋酸法：將多糖采納三氯醋酸法除去蛋白后進行UV掃描顯示，盡管三氯乙酸法除去蛋白的反映較為猛烈，可能會引發多糖的降解，使得率降低，可是三氯乙酸法除蛋白成效較好。因此

12、本研究采納此法進行多糖脫蛋白處置。(2)多糖的柱層析純化：將采納三氯醋酸法去蛋白后的多糖，進一步采納DEAE-纖維素52進行純化，結果顯示通過DEAE-纖維素52純化后，洗脫產物為單一組分。歸并洗脫液，真空濃縮，冷凍干燥，可取得純化的多糖。多糖的鑒定(1)淀粉的碘反映：結果顯示，溶液沒有變藍的現象，說明溶液中不含淀粉。(2)溶解性：通過攪拌，沒有不溶物顯現，說明其溶解性良好。(3)還原糖的測定：在590nm處比色，吸光值為，說明還原糖的含量低。(4)蛋白質的鑒定。通過圖譜能夠得知，在純化后的樣品中于250-280nm處沒有吸收峰，說明其不含蛋白質、核酸及多肽類物質。(5)1R鑒定多糖中糖昔鍵的

13、類型。將純化取得的木瓜多糖進行紅外光譜掃描，結果顯示純化的產物具有典型的多糖特點光譜。經推測本研究純化取得的木瓜多糖極可能是“-D型口比喃糖。(6)多糖的單糖組分鑒定。多糖水解后的HPLC分析見圖2-7o圖中所示結果顯示木瓜多糖水解后的產物只有一個峰，提示木瓜多糖可能只是由一種單糖組成。而且，樣品在水解后生成的單糖并非葡萄糖與半乳糖，吸收峰的要緊部份在葡萄糖與半乳糖之外。具體單糖組分還需要進一步研究加以確信。3結論(1)通過正交實驗對水提醇沉法進行優化，最正確提取條件為水浴溫度90、加水量為45ml、水提時刻為30分鐘。多糖的得率為。(2)多糖的脫蛋白的分離進程中，以三氯醋酸法的去蛋白成效最好

14、。再通過纖維素DEAE-52柱層析進行純化，能取得精制的木瓜多糖。不含有淀粉和蛋白質，游離糖的含量也很低。(3)1R鑒定結果說明本研究取得的木瓜多糖可能是“-D型口比喃糖，HPLC對單糖組分進行鑒定，提示其組成為非葡萄糖和半乳糖組成的單一單糖組成，具體單糖類型有待進一步研究鑒定。參考文獻1方累年.多糖的分離純化及其純度辨別與分子量測定力.藥學通報,1984,19(10):46-49.2 王光亞.粗多糖的測定方式分光光度法.保健食物功效成份的測定方式M.北京：中國輕工業出版社，2002:19-23.3 鄧國棟，郁建平.茶葉多糖提取分離研究口.西南農業大學學報,2002,24(6):546-547

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