1、    風(fēng)濕性心臟病心肌肌球蛋白輕鏈的變化及其對心功能的影響        【摘要】目的探討風(fēng)濕性心臟病(RHD)并心力衰竭患者心肌肌球蛋白輕鏈(VMLC)的變化及其對心功能的影響。方法采用蛋白印跡雜交技術(shù)(western blot hybridization analysis)對13例RHD心力衰竭患者心室肌中VMLC-1、2含量及組成比例進行定量分析；術(shù)前心功能指標(biāo)采用肺動脈漂浮導(dǎo)管（Swan-Ganz 導(dǎo)管）進行檢測；采用t檢驗及相關(guān)分析方法進行分析。結(jié)果VMLC-1、

2、2相對含量RHD組較正常對照組顯著下降，尤以VMLC-2含量下降最為顯著；VMLC-1、VMLC-2組成比例發(fā)生了明顯的改變；VMLC-1、2相對含量的變化與心排血量（CO）、心臟指數(shù)（CI）、左心作功（LCW）、左心作功指數(shù)（LCWI）、每搏量（SV）、每搏指數(shù)（SI）等心功能指標(biāo)密切相關(guān)。結(jié)論VMLC-1、2含量的下降和組成比例的改變導(dǎo)致了心肌收縮功能的損害，參與了RHD心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，是影響RHD心力衰竭患者術(shù)后心功能恢復(fù)的重要因素之一。【關(guān)鍵詞】風(fēng)濕性心臟病；心肌；肌球蛋白輕鏈；心室功能 Alterations of cardiac ventricular myosin light

3、 chains in human ventricular myocardium and the effect on cardiac function in patients of rheumatic heart diseaseLANG Xilong, ZHU Jialin, ZHANG Baoren（Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, PLA, Shanghai200433, China）【Abstract】ObjectiveTo study t

4、he change of ventricular myosin light chains (VMLCs) and effect on cardiac function in rheumatic heart disease (RHD). MethodsUsing Western blot hybridization assay, we detected VMLC-1, VMLC-2 in 13 patients with RHD and 7 cases of health people. Cardiac function parameters were measured by Swan-Ganz

5、 catheter before operation. The results were analyzed by t test and linear correlation analysis. ResultsAs compared with the normal group, the contents of VMLC-1 and VMLC-2 were decreased significantly (P<0.001) in RHD patients, especially the VMLC-2, the ratio of VMLC-1/VMLC-2 in RHD patients va

6、ried from 10.95 to 10.61. Linear correlation analysis showed that the alterations in relative contents of VMLC-1 and VMLC-2 were correlated with the cardiac function such as cardiac output, cardiac index, left cardiac work, left cardiac work index, stroke volume and stroke index. ConclusionThe resul

7、ts show that the values of VMLC-1, VMLC-2 and the ratio of VMLC-1/VMLC-2 are all changed during the development of heart failure in RHD patients, so it might lead to the damage of the myosin structure and affect the cardiac systolic and diastolic functions. These changes may induce a direct effect o

8、n the progressive deterioration of heart function.【Key words】Rheumatic heart disease;Myocardium;Myosin light chains;Ventricular function風(fēng)濕性心臟病(RHD)是引起慢性心力衰竭（心衰）的常見病因。臨床工作中發(fā)現(xiàn)：RHD心衰患者在解除瓣膜功能障礙后，部分患者的心功能并無明顯改善，有些甚至趨于惡化，證明RHD心衰是多環(huán)節(jié)和多因素造成的。心肌收縮蛋白是心肌收縮與舒張功能的最終承擔(dān)者，心室型肌球蛋白輕鏈(VMLC)是心肌收縮蛋白的一種，由1、2兩種亞型組成，有收縮功能

9、和氧化磷酸化功能1，2。其在RHD心衰發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律及其對心功能的影響尚少見報道。本研究擬對RHD心衰患者心室肌中VMLC-1、2含量及組成比例進行分析，結(jié)合術(shù)前血流動力學(xué)監(jiān)測，探討RHD心衰過程中VMLC的變化規(guī)律及其對心功能的影響。資料與方法1. 病例與分組：隨機選擇RHD行二尖瓣、主動脈瓣雙瓣膜置換者13例為RHD組，其中男性7例，女性6例，年齡3254(45.3±7.9)歲，心功能(NYHA)級3例，級10例。對照組7例，男性，年齡2245(38.4±7.8)歲，為腦死亡除外心血管病變者。2. 抗體：鼠抗人VMLC-1單克隆抗體(多倫多大學(xué)臨床生化研究室史沁衛(wèi)

10、博士惠贈)；兔抗人VMLC-2多克隆抗體(California大學(xué)K.R. Chien教授惠贈)。3. 術(shù)前心功能檢測：手術(shù)麻醉誘導(dǎo)前，頸內(nèi)靜脈穿刺置入肺動脈漂浮導(dǎo)管（Swan-Ganz導(dǎo)管）進行血流動力學(xué)檢測，檢測指標(biāo)包括：心排血量（CO）、心臟指數(shù)（CI）、左心作功（LCW）、左心作功指數(shù)（LCWI）；心功能計算方法：66S多功能監(jiān)護儀全自動計算，CO根據(jù)熱稀釋法原理測定3。4. 標(biāo)本采集：心肌組織均取自左室乳頭肌根部，RHD組于術(shù)中體外循環(huán)建立，心臟停跳后30 min內(nèi)取材，正常對照組于腦死亡后24 h內(nèi)取材。5. 心肌組織MLC的提取：采用Shi等4報道的方法稍加改進完成：去除透析步驟

11、,提取過程在4進行, 提取全過程中加入PMSF并保持濃度在1 mmol/L。6. 蛋白電泳：采用5%積層膠，15%分離膠的SDS-PAGE系統(tǒng)。7.蛋白印跡雜交：采用電轉(zhuǎn)移法將凝膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，麗春紅S染色，膜上蛋白條帶清晰，證明轉(zhuǎn)膜成功。將干燥好的硝酸纖維素膜放入雜交管，加入含1%牛血清白蛋白的封閉液，37轉(zhuǎn)動2 h，棄封閉液，加入雜交液及VMLC-McAbs，37轉(zhuǎn)動雜交1 h，棄雜交液，加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37轉(zhuǎn)動孵育1 h，以NBT+BCIP顯色后風(fēng)干，攝片。8.密度掃描定量：每張硝酸纖維素膜對照組的第一樣品均來自同一標(biāo)本，密度掃描時將第一樣品條帶1 mm

12、15;1 mm面積密度值定為1.0，從而計算出第一樣品條帶密度值，其余各條帶密度值以第一標(biāo)本密度值為標(biāo)準(zhǔn)，由凝膠像分析儀自動測得。9.統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組之間的統(tǒng)計采用t檢驗方法，相關(guān)分析采用直線回歸方法，檢驗及分析過程在NCSS統(tǒng)計軟件上完成，P值以計算值表示，P<0.05為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。結(jié)果1. VMLC-1, VMLC-2 Western blot雜交結(jié)果見1，2。注：1、2為對照組，38為RHD組1VMLC-1 Western blot雜交顯影注：15為對照組，610為RHD組2VMLC-2 Western blot雜交顯影2.心肌組織中VMLC

13、各亞型含量的變化: (1) VMLC-1，VMLC-2的變化： VMLC-1相對含量RHD組較對照組顯著減少18.43%(0.992±0.2491.216±0.154, P<0.05)；VMLC-2相對含量RHD組較對照組顯著減少32.74%(0.798±0.2551.191±0.132, P<0.001)；VMLC-2較VMLC-1顯著減少19.50%(P<0.001)，對照組VMLC-1、2含量差異無顯著性(P>0.05)。(2) VMLC-1/VMLC-2比值：RHD組10.9510.61，正常組11.0210.96。3.

14、VMLC-1，VMLC-2相對含量與心功能的關(guān)系：將VMLC-1，VMLC-2相對含量與血流動力學(xué)參數(shù)作直線相關(guān)分析顯示：VMLC-1含量與CO、CI、LCW、LCWI呈顯著正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.745、0.568、0.729、0.675； VMLC-2含量亦與上述血流動力學(xué)參數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.828、0.623、0.868、0.793。討論正常心臟組織中肌球蛋白（myosin）是由兩條重鏈(MHC)及四條輕鏈(MLC)組成的六聚體，肌球蛋白輕鏈(MLC)是肌球蛋白分子的主體和骨架，有收縮功能和氧化磷酸化功能1。因此，MLC-1、

15、MLC-2兩亞型含量下降將導(dǎo)致心肌收縮功能的損害。在成人心房及心室肌中，其相應(yīng)的兩種亞型MLC的總量組成為115，6。Hailstones等7研究發(fā)現(xiàn)，正常人各種肌肉組織中，MLC-1，MLC-2是成對出現(xiàn)的、由兩條MHC，兩條MLC-1，MLC-2組成的肌球蛋白，其收縮效能最高，因此MLC-1，MLC-2兩亞型組成比例上的異常必將導(dǎo)致心肌收縮力的下降。我們應(yīng)用Western 雜交方法，觀察RHD心衰患者心室肌中VMLC-1、2相對含量及其組成比例的變化。結(jié)果顯示：VMLC-1、2相對含量較正常對照組均有明顯下降，其中尤以VMLC-2含量下降最為明顯，心肌中VMLC-1/VMLC-2比值發(fā)生了

16、明顯的變化（10.9510.61）。Schaper等8在擴張型心肌病終末期心衰患者的研究中亦證明VMLC-2含量明顯下降甚至消失; VMLC-1/VMLC-2比值降至10.110.69，并認(rèn)為VMLC-2的下降是由MLC激酶分解所致，它可特異性分解VMLC-2而重鏈不受影響9；Hofmann等10，11通過實驗驗證， VMLC-2的缺失可使肌球蛋白和肌動蛋白的解離速度下調(diào)，從而影響心室的舒縮功能。由于VMLC-2本身可氧化磷酸化，參與心肌舒縮時的能量供應(yīng)，其含量的下降，勢必影響到心肌舒縮時的能量供應(yīng)，同時上述兩種輕鏈含量的下降，使得心肌肌原纖維的結(jié)構(gòu)遭到破壞，勢必影響到心肌的收縮功能，我們通過

17、心功能檢測證實了上述結(jié)論，即VMLC-1，VMLC-2的相對含量與CO、CI、LCW、LCWI等心功能指標(biāo)有良好的相關(guān)性。因此，我們認(rèn)為RHD心衰患者心室肌中VMLC兩亞型含量的下降和比值的改變參與了RHD心衰的發(fā)生發(fā)展，是影響RHD心衰患者術(shù)后心功能恢復(fù)的重要因素之一。（本文編輯：寧田海）基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（39670716）作者單位：郎希龍（200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外科）朱家麟（200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外科）張寶仁（200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外科）郝家驊（200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外

18、科）吳弘（長海醫(yī)院心內(nèi)科）朱泉芳（200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外科）參考文獻1，F(xiàn)ugimoto K, Yasue H, Nakao K, et al. Novel monoclonal antibodies specific for human cardiac myosin light chain-1: useful tools for analysis of normal and pathological hearts. J Histochem Cytochem, 1993, 41: 35-422，Holt JC, Caulfield JB, Norton P, et

19、al. Human cardiac myosin light chains: sequence comparisons between myosin LC-1 and LC-2 from normal and idiopathic dilated cardiomyopathic hearts. Mol Cell Biochem, 1995, 145 : 89-963，Karen SB. Thermodilution right ventricular ejection fraction measurements: room temperature injectate. Crit Care Me

20、d, 1994,22:1136-1141. 4，Shi QW, Peter MO, George J. Comparison of ion-exchange chromatography, isoelectric precipitation and reversed-phase high-performance liquid chromatography for the separation of individual cardiac myosin light chains. J Chromatography, 1991,572: 59-71. 5，Shi QW, Danilczyk U, W

21、ang JX, et al. Expression of ventricular myosin subunits in the atrial of children with congenital heart malformations. Circ Res, 1991, 69:1601-1607. 6，Lowey S, Waller GS, Trbus KM. Skeletal muscle myosin light chains are essential for physiological speeds of shortening. Nature, 1993, 365: 454-456. 7，Hailstones D, Batton P, Thomas PC, et al. Differential regulation of the atrial isoforms of the myosin light chains during striated muscle development. J Biol Chem, 1992,267: 23295-23300.8，Schaper J, Fro