1、人發角蛋白人工腱研究進展5人發角蛋白人工腱研究進展肖應慶董為人人發角蛋白(Human Hair Keratin, HHK)人工腱，是一種植入人體內可被降解 吸收、并能誘導自體腱形成的新型生物性支架材料；按其誘導自體腱形成的機 理，也可以稱之為 在體HHK組織工程腱(in vivo HHK-engineering tendon)”。 大量的實驗研究和臨床實踐證明，它是目前創傷、矯形和修復重建外科中，腱或 韌帶缺損修復和功能重建比較理想的代用品。一、HHK人工腱研究的歷史背景由于創傷或疾病所造成的肌腱缺損、短縮、變形、或手部肌腱先天性缺如等導致 的肢體功能障礙，需進行手術修復。傳統的修復方法是自體

2、肌腱移植或肌腱轉位 術，其最大的優點是無免疫排斥反應，銜接部位能組織愈合，結合牢固，恢復正 常的解剖和組織結構，保持了肢體功能活動所需的生物力學性能。所以，從20世紀初開始，一直延續至今，臨床上仍在使用。其不足之處是要犧牲一條或多條 正常肌腱，遇到多條肌腱缺損或缺如的病例，取材就非常困難。再者，從自體切 取肌腱，不僅增加手術創傷，也會影響供肢的功能。而且這種拆東墻補西墻”的方法，也不易為患者所接受。因此，應用肌腱代用品，是解決上述問題的一個途 徑。近百年來，國內外先后有人采用絲織品、合金、火棉、鉭絲織品、塑料、尼龍、 滌綸、合成纖維、碳素纖維、硅橡膠、動脈管、聚脂纖維、羥基磷灰石和未經改 構處

3、理的人發等用于制作人工腱。其中有些材料組織相容性差，異物反應大而被 排斥；有些材料植入后因萎縮而失敗；有些材料隨植入時間的延長發生裂解或降 解，拉應力逐漸衰減，不能達到恢復功能的目的；有些材料與受體部位周圍組織 發生廣泛粘連，嚴重影響肢體的功能活動；大多數人工腱與受體腱吻合口不能形 成纖維愈合，最終在結合部位發生斷裂，因而只能作為暫時的代用品，未能取得 遠期成功。總之，未找到臨床上有永久使用價值的比較理想的人工腱材料。為研制出一種臨床持久性較好的人工腱，戴尅戎等用硫化硅橡膠管作外殼，管芯 充填桑蠶絲織品和兩根供縫合用的滌綸線。雖然人工腱的硅橡膠外殼與周圍組織 不發生粘連，兩端與受體肌腱吻接部有

4、大量纖維組織與絲纖維相互交織，和腱芯 中的絲纖維間能逐漸形成貫通兩端的纖維組織，以承擔拉力，但仍然存在異物反 應大等缺點。在手部無人區作人工腱移植的 11例患者中，即有5例因排異而失 敗。顯然，這樣的結果，臨床很難推廣應用。為尋找出一種異物反應小、臨床持久性較好的人工腱材料，黃鳳鳴等用人發編織 成肌腱，植入兔大腿半腱肌肌腱離斷部位。術后局部不出現紅腫及炎性滲出物， 結合部纖維母細胞可以長入人發腱內部，并包繞每根人發而牢固愈合，但活動度差，與肌腱下筋膜發生粘連，并且隨時間延長粘連逐漸加重。臨床應用11例，全身及局部反應均不明顯。用于大腿和臀部肌腱修復粘連輕微，但用于手部指肌 腱修復時效果較差。此

5、后，也很少見有臨床應用的報道。20世紀90年代前，人工腱的研制實際仍處于實驗階段。為了解決臨床的需求， 人們的視線又先后回到了異體腱上。本來早在 20世紀50年代，Peacock等研究 了同種異體腱，由于當時應用的是未經處理的新鮮異體腱，結果發現有明顯的炎 性反應和排斥反應，移植腱出現壞死現象。因此，臨床難以應用。20世紀80年代，Min ami通過動物實驗，提出了肌腱的抗原性主要存在于腱細胞表面的組織相 容性復合物(HLA-Dr)，而不在膠原纖維，并且通過冷凍，可以顯著降低其抗 原性。43212基金資助(1)人發角蛋白人工腱誘導機體自體腱形成機理的研究 ”國家自然科 學基金重點項目(M :3

6、9830390)(2) 人發角蛋白的醫學應用”國家“863”究項目(M:102090503);(3) 人發角蛋白人工腱”“97國家重點基礎研究發展規劃項目組織工程基本 科學問題中的子專題(M:G1999054308) (4)人發角蛋白人工腱”廣州市科技攻關項目(M:200020170105)。作者單位第一軍醫大學1.生物化學教研室2.組織學與胚胎學教研室，廣州，5105156人發角蛋白人工腱研究進展張友樂等5,6對異體腱采用超低溫冷凍和冷凍干燥處理，在一定程度上改變肌腱細胞的結構， 抑制和破壞肌腱細胞HLA-Dr的抗原性，但仍然保留了肌腱組織的基本結構及部 分活性，為肌腱移植后修復提供了良好基

7、礎，與自體肌腱移植的結果無明顯差 異。這樣，對異體腱在臨床上的應用，無疑是向前推進了一大步，以至于至今臨 床應用仍比較普遍。目前，國內外用于臨床的異體肌腱基本上均為冷凍和凍干肌腱，但尚存在以下問 題：(1)材料來源困難；(2)嚴格的無菌操作和供體篩選(包括微生物學、血 清學檢測及病理組織檢查)，操作復雜，而且仍不能完全排除疾病(特別是 HIV和HBV等感染）傳播的可能性；（3）存在粘連比較嚴重和潛在的排斥反應；（4）愈合時間長7；（5）拉應力衰減明顯8；（6）冷凍處理、建立提供商品化肌腱的組織庫需要一定的設備。20世紀80年代，提出了組織工程這一嶄新的概念。人們開始轉向通過組織工程 途徑來解決

8、人體肌腱或韌帶的替代材料。項舟等9PGA加膠原表用人胚腱細胞與碳纖維增強聚羥基乙酸（PGA）外加膠原表面涂層聯合培養，腱 細胞貼附于材料上，且增殖，合成膠原，形成網狀纖維纏繞。將其移植于動物體 內，橋接肌腱殘端。術后4周，觀察到植入物間膠原纖維組織趨于致密組織結 構，有大部分膠原纖維已連接肌腱殘端。結果表明，碳纖維增強 面涂層材料作為支架，與腱細胞聯合體外培養，可以成為一種永久性的有生命活 性的組織工程肌腱。但組織工程肌腱大批量用于臨床尚有許多問題待解決，如種 子細胞的組織相容性、老化和功能退化；支架材料的生物相容性、生物親和力、 降解速率與細胞生長的同步性；種子細胞來源的選擇，構造模擬人體的

9、三維張力 環境等。在上述領域均取得突破性進展以后，還需研究這種材料從實驗室過渡到 人體的中間環節，包括這種材料的保存方法、保存后的活力、植入前的復蘇，及 其對材料的影響、運輸方式、體內植入后的反應等，即產業化研究。為此，人們仍在致力于尋找和研制肌腱永久性替代物 一一理想的人工腱：（1） 組織相容性好，不發生排斥反應；（2）可被機體吸收，同時誘導形成新的自體 腱；（3）腱的銜接部位能組織愈合，拉應力無衰減；HHK人工腱。（4）可屈性、繞彎性好；（5）無粘連，有良好的滑動性；（6）容易消毒、貯 存。在這種歷史背景下，誕生了一種完全新型的人工腱 二、HHK人工腱的實驗研究HHK人工腱的研究始于199

10、1年，當時主要有第一軍醫大學生物化學教研室王鐵 丹、肖應慶和第一軍醫大學南方醫院骨科曹啟迪3人具體參與。在此之前，黃鳳鳴等2以未經改構處理的人發代腱，其拉應力不易衰減，組織相容性也較好，但不能被 機體吸收，與周圍組織發生粘連，一經感染便成為異物。針對這樣的結果，王鐵 丹、肖應慶和曹啟迪認為解決這一問題的關鍵是要預先對人發進行改構處理，使 其植入后能被機體降解吸收并誘導形成新的自體腱。根據他們各自的專業特長， 由王鐵丹、肖應慶具體負責對人發進行改構的生物化學處理，并對改構處理后人 發的理化性質、生物學性能及生物力學特性進行測定分析；曹啟迪具體負責用經 生物化學改構處理過的人發進行動物實驗和臨床觀

11、察。1. 對人發進行改構的生物化學處理 人發中主要成份為a角蛋白，a角蛋白富含半胱氨酸，并且半胱氨酸上的巰基（ SH） 與鄰近多肽鏈中半胱氨酸上的巰基（-SH）交聯，形成含二硫鍵（-S - S-）的胱氨酸，使人發結構處于一種非常穩定的狀態。因此，人發能經受得起一定的 拉力，在自然條件下基本不降解。對人發進行序貫的、不同程度的可控制性生物 戊二醛合劑”處理），不同程度地改變HHK的結 Z）、中（B）、快（F）不同吸收速度的三種B組分處理較劇烈， HHK在機體內的吸收Z、B 和 F王鐵丹和肖應慶10 就人發中角蛋白的特殊化學結構， 化學處理（非早期文獻中報道的 構，使其成為在機體內具有慢（HHK人

12、工腱。HHK組分材料。Z組分處理較緩和，人發結構改變較輕微； 人發結構改變較大；F組分處理劇烈，人發結構改變最大。 速度與生物化學處理的劇烈程度和人發結構改變的大小成正相關。將 三種組分材料以一定的比例，混合編結成橫截面為橢圓形的2. HHK人工腱材料的化學成份分析 作為植入體內的可吸收生物材料應用于臨床，其前提是生物材料的降解產物必須 無毒，終產物能循入機體正常的代謝途徑。為此，肖應慶等11 將HHK人發角蛋白人工腱研究進展7 人工腱Z、B、F三種組分材料和未經生物化學處理的正常人發徹底水解，對其化 學成份進行分析。結果均是只有1%左右的無機成份，其余全部是氨基酸。其中 胱氨酸含量，未經生物

13、化學處理的正常人發約占 11%，而HHK人工腱Z、B、F 三種組分材料均只有5%左右（由于胱氨酸是采用自然氧化法測定的，此含量中 還有相當一部分是由半胱氨酸氧化而來的，實際胱氨酸的含量還遠低于這個 量）。結果表明：（1）Z、B、F三種組分和正常人發基本上均由蛋白質組成。顯然， HHK人工腱在體內的降解產物對機體不但無害，而且有益，為HHK人工腱植入人體提供了可行性依據；（2）人發經生物化學處理后，胱氨酸大量丟失。意即 HHK多肽鏈中大量的二硫鍵斷裂，破壞了人發穩定的化學結構。可能這就是 HHK人工腱在體內能被降解吸收的主要原因。3. HHK人工腱材料的化學性質和生物學性能 HHK人工腱應用于臨

14、床，還要使 其化學性質基本不影響機體正常的生理內環境，其生物學性能對機體無論是近期 還是遠期都應無不良影響，沒有潛在危險。研究者們10從人發原料的采集、清洗到生物化學處理所用試劑及其整個制作過程的設計，都 作了充分、周密的考慮。人發采自無地方流行性疾病、無環境污染的偏遠山區、 無染發和燙發的健康年輕女性黑發；清洗不用一般的洗發水（精），而是與生物 化學處理程序有機地結合在一起；所用處理試劑為藥典醫用，對人體無害。取生物化學處理后的HHK人工腱材料制備浸提液，對其化學性質和生物學性能進行 檢驗分析。檢驗結果12:PH7.0 7.5,金屬離子V 1mg/L,無細菌生長，無熱原反應，無毒性反應，溶血

15、率為2.6%，細胞毒性WI級，皮膚致敏率0 %，鼠傷寒沙門氏菌回復突變（Ames）試驗陰性，動物骨髓嗜多染細胞 微核試驗陰性，小鼠精子畸形檢測試驗陰性。表明HHK人工腱的化學性質和生物學性能完全符合植入人體的要求。4. HHK人工腱材料的生物相容性和組織相容性 為進一步研究和應用HHK人工腱 材料提供生物學依據，而生物材料中一些易溶出物質又往往是引起炎癥反應和組 織反應的主要因素。因此，肖應慶等13、陸聲14和傅文玉等15先后分別用HHK人工腱材料的浸浸提液不但對細胞的生長、增殖、形態、代謝、細胞膜的完整I型膠原的表達及超微結構等均無影響，而且浸提液組還優于 提示HHK人工腱浸提液對細胞不但沒

16、有毒性，而且像似具有 這可能與細胞攝取 HHK人工腱材料在浸提過程中釋放的氨基提液與L929細胞系、人胚腱細胞（HETC）和人骨髓間充質干細胞（MSCs）共 培養。結果表明： 性、蛋白質含量、 單純生理鹽水組。一定的營養作用。酸等營養成份有關。為提供更充分的HHK人工腱材料生物相容性依據，在此基礎上還通過直接接觸 法檢測了其生物相容性。陸聲14和傅文玉等15先后分別用HHK人工腱材料與HETC和MSCs聯合培養，均發現細胞與材料有極好的粘附性和相容 性。是一種比較理想的可吸收生物性支架材料，可作為細胞外基質應用于組織工 程研究。體外細胞培養法檢測材料的生物相容性雖具有敏感性高、重復性好、可定量

17、和直 接觀察對組織細胞影響等優點，但它是一種短期的離體實驗。HHK人工腱材料有無抗原性，植入人體后有無排斥反應，還有必要作進一步的觀察。李其訓等16用HHKHHK人人工腱植入兔體內，于術后不同時間進行淋巴細胞轉化試驗。結果表明， 工腱基本無抗原性，不能刺激淋巴細胞轉化。 為了解HHK人工腱材料對機體的直接作用，鄒云雯等17將HHK人工腱材料埋植于大鼠皮下。一 般觀察，傷口愈合良好，未見排斥反應。分別于術后2、8和12周取埋植材料和周圍組織進行組織學觀察。結果表明：HHK人工腱材料對機體組織的刺激性明顯低于正常人發，與動物的組織相容性較好。其后在臨床試用期間，以行HHK人工腱移植術的14例患者為

18、實驗組，同時選25例行其它骨科手術的住院患者作對 照組，采外周血進行免疫學指標檢測。結果實驗組與對照組之間，以及實驗組自 身術前與術后比較，均無顯著性差異。表明 HHK人工腱植入人體不能刺激機體 產生免疫反應。需長期植入體內的生物材料，尤其作為一種可降解的生物材料，需證實其降解產 物對周圍組織有無影響。王貴波等18,19、陸聲等20,21先后分別將HHK人工腱材料埋植于兔脊旁肌內，進行了系統的觀察。結果表明，HHK人工腱材料與周圍組織有良好8人發角蛋白人工腱研究進展的相容性。認為HHK人工腱材料是一種理想的可降解醫用生物材料。5. HHK人工腱的生物力學性能HHK人工腱作為人體肌腱或韌帶的代用

19、品，除了要有良好的生物相容性和組織相 容性外，還需具有一定的抗拉強度。肖應慶等22Z、B和F組HHK人0.9982 和測定了 HHK人工腱及其各組分材料的主要生物力學性能指標，發現 分在橫截面積等同的條件下，斷裂拉力、拉應力和剛度均依次遞減，而 工腱的斷裂拉力和剛度均隨橫截面積增大而增加，相關系數分別為0.9896。提示HHK人工腱的斷裂拉力、拉應力和剛度均隨生物化學處理程度的加 重和在體內被吸收速度的加快而減小。據此，可以通過控制對人發的處理程度和 HHK人工腱各組分材料組合的比例，來滿足人體不同部位肌腱對HHK人工腱拉應力的需要，同時也便于根據不同功能部位選用合適規格型號的HHK人工腱。生

20、物降解材料作為誘導支架，其最低力學性質需維持到缺損組織再生為止。為了 解HHK人工腱從植入機體到形成新的自體腱整個過程中的生物力學性能，王前 等23對其進行了測評。將HHK人工腱、碳纖維腱和自體腱分別植入兔跟腱缺損處，第12周后，HHK人工腱組最大拉應力均值（12.70MPa）為碳纖維腱組（5.88MPa）的2.16倍，為自體腱移植組（13.44MPa）的94.5%,達到了肌腱修 復術中對結構和功能重建的要求。實驗結果表明，HHK人工腱修復肌腱缺損的腱化進程與自體腱相同。腱化過程不僅是一種形態結構的改建，而且是力學性能的 恢復。由于HHK人工腱是由慢（Z）、中（B）、快（F）不同吸收速度的三種

21、 組分材料，以一定的比例混合編結而成，這就保證了使其具有足以供植入人工腱 的肢體、指（趾），從植入人工腱到形成新的自體腱過程中，進行功能活動所需 拉應力的連續性。6. HHK人工腱植入的動物實驗人發經生物化學改構處理，編織成 HHK人工腱后，在對其進行理化性質、生物學性能等分析的同時開始了動物實驗。曹啟迪等24應用HHK人工腱植入新西蘭兔跟腱缺損部位。第6周，植入物被大量膠原纖維包繞分成小塊，未吸 收的HHK人工腱材料內已長入膠原纖維，并有巨噬細胞。第 8周，植入 物外觀與正常機體腱不易區別，銜接部已不清楚，大部分植入物被吸收并膠原 化。第12周，植入物完全被膠原纖維替代，大部分已腱化為機體腱

22、組織。表明 HHK人工腱植入兔跟腱缺損部位，12周已被吸收并誘導基本形成了新的自體 腱。其后，李其訓等16重復了同樣的實驗。第6周，植入的HHK人工腱被膠原纖維包繞并分割成小塊，人發周圍可見巨噬細胞和膠 原纖維。第8周，人工腱與跟腱銜接部已不清楚，出現大量的膠原纖維，大部分 植入物被吸收并膠原纖維化。第12周，植入的HHK人工腱基本消失，被成纖維 細胞和膠原纖維取代，排列規則，大量成纖維細胞逐漸轉化為纖維細胞，形成了 新的自體腱。在不同的時間段（1996年，1997年），不同的地域（廣州，昆明），采用同樣 的材料（HHK人工腱）、同樣的動物（新西蘭兔），進行同樣的實驗（替代跟腱 缺損3cm），

23、得出了同樣的結果：HHK人工腱植入兔跟腱缺損處，逐漸被降解吸 收，同時誘導形成新的自體腱。這一過程，大約需要12周。這樣，可以基本證實其結果的真實性和可靠性。隨后，樸英杰等25,26、婁莉27和王貴波等18,19先后分別用HHK人工腱替代兔跟腱修復缺損，蔣東萍等28用HHK人工腱替代兔腓腸肌肌腱修復缺損，胡慶柳等29用HHK人工腱替代兔后腿屈肌腱修復缺損，也都得出了類似的結果。進一步證實了應用 HHK人工腱替代機體肌腱修復 缺損的過程中，在被機體降解吸收的同時，誘導形成新的自體腱這樣一個事實的 真實性和可靠性。7. HHK人工腱機理的研究HHK人工腱植入肌腱缺損部位后，可逐漸被機體降解吸收，并

24、誘導自體腱形成。 這是人工腱研究史上的一大突破，引起了國家和地方政府的高度重視，先后注重 資予以大力支持；同時也引起了同行們的濃厚興趣。于是便開始了探求其機理的 深入研究。(1)體內降解吸收機理如前所述，HHK人工腱的化學本質基本上全是蛋白質，HHK人工腱在體內的降解亦即蛋白質降解。真核細胞的蛋白質降解途徑包括泛素依賴途徑、溶酶體依賴 途徑和Ca2+ 依賴途徑等30。樸英杰等26對HHK人工腱在體內降解過程的觀察發現，人發角蛋白人工腱研究進展9HHK人工腱植入機體后第1周，人發毛皮質外層可見透明的毛小皮層，胞質內充 滿膠質蛋白，偶爾可見細胞之間的橋粒結構。毛皮質內見有散在棕色顆粒，與正 常毛發

25、無明顯區別。毛小皮層表面散在附著巨噬細胞。第3周，可見人發毛小皮塌陷，毛皮質開始均質并顆粒化。人發周圍巨噬細胞三五成群聚集，相互融合成 多核巨細胞，胞內可見被吞噬的人發降解顆粒。第 6周，F組分已完全降解吸 收，這時B組分人發的毛小皮開始脫落，并部分降解吸收。第912周，除剩余少量Z組分外，大部分HHK人工腱材料已降解吸收。因此，同一視野內可同時 觀察到不同降解階段的HHK人工腱材料。泛肽酶標記反應：第 1、3周，在 HHK人工腱材料周圍的巨噬細胞、多核巨細胞和成腱細胞內呈強陽性，周圍的基 質呈中等陽性；第6周，巨噬細胞和多核巨細胞內仍呈強陽性，周圍的基質呈弱 陽性；第912周，大部分HHK人

26、工腱材料降解，被新生的腱組織取代，在基質 中呈弱陽性，而在新生腱細胞中呈中等陽性。形態學觀察20,21,27,28表明，HHK人工腱植入后首先是中性粒細胞出現在人發周圍，2周之內中性粒細胞消失。這可能與手術造成的創傷或局部感染有關，中性粒細胞并不參與HHK人工腱的降解。與此同時，由于 HHK人工腱的植入導致周圍的巨噬細胞和多核 巨細胞處于應激狀態。因此，第 36周，人發周圍出現大量的巨噬細胞和多核巨 細胞。巨噬細胞和多核巨細胞在靜止狀態時，胞內溶酶體數量相對較少，一旦與 異物接觸，溶酶體數量劇增。在各組分降解的早期，由于HHK人工腱材料體積實在太大，巨噬細胞和多核巨細胞并不參與吞噬。在上面實驗

27、26中觀察到，第39周均出現了泛肽酶標記反應呈強陽性，并伴隨有F、B、和Z組分依次在第39周出現斷裂、脫落，進而逐漸呈均質狀。顯然，細胞的泛素依賴降解途徑被激 活，由26S的蛋白體酶在細胞外對 HHK材料進行降解。當HHK材料降解成大小 不等的顆粒后，多核巨細胞將較大的顆粒以胞吞的方式吞噬，而較小的顆粒則由 巨噬細胞吞噬。然后在細胞內形成異噬性內吞體，內吞體與溶酶體融合，在酶的 作用下將其水解。根據形態學的觀察結果推斷，在 HHK人工腱降解過程中，F組分在第36周到達 降解后期，B組分在第69周達到降解后期，而Z組分則是在第912周達到降 解后期。由此可見，F組分的降解后期可能與B組分的降解中

28、期重疊，B組分的 降解后期可能與Z組分的降解中期重疊。因此，在 HHK人工腱體內降解的整個 過程中，都可觀察到人工腱材料被不同程度地降解與自體腱逐漸形成并存的現象16,20,21,25-27,31。綜上所述，HHK人工腱在體內的降解方式可以歸納為：在各組分降解早期，主要 是泛素依賴降解途徑在細胞外發揮作用；在各組分降解后期，主要是溶酶體依賴 降解途徑在細胞內發揮作用。兩者間有精確的協同作用。（2）誘導自體腱形成機理 在HHK人工腱的實驗研究中16,18,19,23-31，已經觀察到HHK人工腱植入機體肌腱缺損部位后，在其降解吸收過程中逐步形成新的自 體腱。為探索其形成機理，樸英杰等25用HHK

29、人工腱植入兔跟腱缺損處，通過電鏡較系統地觀察了 HHK人工腱形成自體腱的有關細胞及其超微結構的改 變：植入后14周，巨噬細胞和成纖維細胞向植入物內遷移，HHK人工腱出現降解，同時大量成體腱干細胞在肌腱兩端開始脫分化，分裂增殖成腱形成細胞（簡 稱成腱細胞），并遷入降解區；植入后 57周，大部分HHK人工腱被降解吸 收，成腱細胞進一步分化，胞體變大變長，含有豐富的高爾基復合體和粗面內質 網，向細胞外分泌膠原蛋白，并在細胞外聚合，形成大量排列不規則的新生膠原 纖維。植入后第35個月，在成腱細胞進一步形成膠原纖維的同時，分泌膠原 酶，并降解排列不規則的膠原纖維，逐步轉變為排列規則的膠原纖維；植入后第

30、67個月，成腱細胞進一步分化，胞體伸出多個薄板樣的翼狀突起插入纖維束之 間。之后胞體進一步變長，突起進一步變薄，功能逐漸停滯，演變成腱細胞。在 這一過程中，粗細不等的膠原纖維逐漸變粗，排列規則，不斷成熟，形成具有正 常腱功能的自體腱。樸英杰等26在其后的實驗中，重復觀察到了類似的現象：HHK人工腱植入后第3周，毛發之間出現 新生的成腱細胞，有時可見到細胞分裂相。第 6周，成腱細胞開始分泌 10人發角蛋白人工腱研究進展基質并形成纖維。第912周，大部分HHK人工腱降解吸收，被新生的腱組織取 代。前后兩次實驗的結果證實了一個事實：HHK人工腱植入機體肌腱缺損處后，在其降解吸收的同時，肌腱殘端的成體

31、腱干細胞活化、分裂、增殖，并遷移至腱 缺損處，粘附于HHK人工腱材料表面，合成并分泌膠原，在胞外組裝成膠原纖 維，進而形成機體自體腱。在此基礎上，婁莉27對自體腱形成的機理作了進一步的研究觀察。將HHK人工腱植入兔跟腱缺損處，分別于 1、3、& 9、 12、16、20周取材進行組織學和超微結構觀察。在整個過程中觀察到：植入后 3 周，便發現成腱細胞附著在 HHK人工腱材料表面并包繞每根人發，增殖成膜， 成為自體腱形成的原基。繼而成腱細胞活化，形成腱細胞，并不斷分裂、增殖， 生成大量功能活躍的腱細胞。這些腱細胞合成前膠原蛋白并分泌到細胞外，在胞 外聚合形成膠原蛋白，繼而聚合成膠原原纖維，

32、若干膠原原纖維經糖蛋白聚合成 膠原纖維。后期膠原纖維在膠原酶和拉應力的作用下，使膠原纖維排列規則、致 密，方向與人工腱長軸一致。采用 RT-PCR技術，HHK人工腱植入第3周即可觀 察到I型膠原蛋白的mRNA表達，第6周達到高峰，第20周表達量仍高于正常 肌腱。這一結果與蔣東萍31測定HHK人工腱植入兔跟腱缺損處后，新生腱組織中羥脯氨酸含量的結果非常 吻合。植入后3周，羥脯氨酸含量開始增高，第 6周達到高峰，第9周開始回 落，但仍高于正常肌腱。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，新生腱組織中羥脯 氨酸的含量能較準確地反映膠原蛋白的合成量。上述這些結果，在分子水平進一 步證實：HHK人工腱植入機體肌

33、腱缺損處后，形成自體腱的過程是腱細胞合成和 分泌I型膠原，最后聚合、組裝成膠原纖維的過程。另外，正常腱組織中，膠原纖維占將近 90%，細胞成份約占10%，但在新形成 的腱組織中，腱細胞數量遠遠超過了這個比率。最新的研究發現32在自體腱形成晚期，腱細胞自身膠原化，無論是胞漿還是胞核，均被膠原纖維所 替代。這可能是一種新的細胞凋亡類型，類似皮膚表皮細胞角質層細胞的角化過 程。這也是新形成的自體腱改建、塑形的一個過程和完善為正常肌腱的結果。 上述實驗研究闡明了 HHK人工腱形成自體腱的過程，但 HHK人工腱是如何誘導 該過程的尚不清楚。HHK人工腱完全水解后的產物是含量不等的各種氨基酸，但 在植入機

34、體后，要經歷一個逐步降解、吸收的復雜過程。其中間產物有的是蛋白 質，有的是含各種氨基酸殘基數目不等的肽類物質。可以推測，在這些中間產物 中，可能含有一些有助于細胞粘附的功能信息和誘導機體細胞分泌一些細胞因子 的物質。細胞因子對促進細胞分裂、增殖，合成、分泌膠原以及調控膠原的沉積 和降解、血管再生等都起到舉足輕重的作用。婁莉等27通過RT-PCR技術證實：（1）腱細胞和巨噬細胞能合成、分泌細胞轉化生長因子 （TGF）- 3 1堿 性成纖維細胞生長因子（bFGF）和金屬基質蛋白酶（MMP）-1與金屬基質蛋白酶組 織抑制物（TIMP）-1 ; （ 2）在自體腱形成過程中，TGF- 31和bFGF的m

35、RNA表達 量增高，且遠高于正常肌腱；（3） TGF- 3 1和bFGF可誘導腱細胞增殖、分化， 促進I型和m型膠原的合成和分泌，并可調節膠原的沉積，調控血管增殖；（4） MMP-1與TIMP-1相互拮抗，調節膠原的降解，對新生自體腱進行改建和 塑形，最終形成與自體腱結構和功能相同的新自體腱。蔣東萍33將HHK人工腱植入兔跟腱缺損處，也觀察到：2周后鞘壁網狀的幼稚結締組織細胞質中 bFGF mRNA呈強陽性反 應，36周后成纖維細胞中TGF- 3 2 mRNA呈強陽性反應，9周后和正常肌腱細胞 中bFGF mRNA、TGF- 3 2 mRNA均呈弱陽性反應或陰性反應，表明此時細胞已轉 向靜止期

36、。顯然，這一結果與新生腱組織中I型膠原蛋白的表達和羥脯氨酸的含量互為因果關系。胡慶柳等29用原位雜交法檢測TGF-B,發現TGF- P 1 mRNA僅存在于HHK人工腱周圍的腱細胞、 滲入的成纖維細胞和炎癥細胞中，TGF- P 2 mRNAT泛存在于新生腱組織中，在半 成熟的腱組織中也有表達，而 TGF-P 3 mRNA在新生腱組織和較成熟的腱組織中 表達量很低。由此看來，TGF- P1 P2在肌腱修復中可能起主要作用，而 TGF-P3 可能只是起協同作用。HHK人工腱誘導機體形成自體腱的機理，可以概括為：HHK及其降解產物活化巨噬細胞、成纖維細胞和成體腱干細胞等分泌細胞因子，促進成體腱干細胞

37、分化 為腱細胞，腱細胞分裂、增殖、合成并分人發角蛋白人工腱研究進展11泌膠原，在胞外組裝成膠原纖維，進而形成機體自體腱。其中多余”的腱細胞，也可能是在細胞因子的調控下，自身膠原化，使新形成的自體腱逐漸改建、塑形 成正常肌腱。三、HHK人工腱的臨床應用研究經動物實驗，證實HHK人工腱：組織相容性好，無明顯抗原性，不發生排斥反 應；可被機體降解吸收，并在降解吸收過程中形成新的自體腱；拉應力無明顯衰 減；無影響功能活動的粘連。在此基礎上，開始了臨床應用研究。1.臨床驗證第一軍醫大學南方醫院曹啟迪等34，應用HHK人工腱治療臨床患者51例，男39例，女12例，年齡1046歲。其 中代跟腱10例，膝反張

38、固定7例，膝關節側副韌帶修復重建術11例，膝交叉韌 帶替代術8例，伸指肌腱缺損替代術8例，屈指肌腱替代術7例。51例中，上肢 伸屈指腱替代術15例，術后3周可恢復功能活動；下肢跟腱斷裂、膝反張、膝 側副韌帶和膝交叉韌帶斷裂，行修補、腱固定、及重建術共36例。下肢術后3周，病人行非持重活動。1個半月，恢復持重勞動。隨訪時間3個月至4年，功 能恢復達優者49例，良者2例，優良率100%。成都軍區昆明總醫院李其訓等35 ，1995 年 6月至2001年8月，臨床應用HHK人工腱治療患者223例（238條腱）。其中男 性201例，215條腱；女性22例，23條腱。損傷原因，車禍傷126例，機器傷 65

39、例，火器傷24例，其他傷8例；損傷部位，屈指肌腱80例，84條腱；重建抬 肩屈肘54例，62條腱；膝交叉韌帶35例，35條腱；膝側副韌帶28例，31條 腱；跟腱26例，26條腱。根據損傷的部位與性質，選用相應規格型號的 HHK人 工腱移植和功能重建術。術后肢體只需制動 13周，待切口完全愈合即可行關節 功能活動。病人無發熱等不良反應，切口無紅腫情況。除有5例屈指肌腱替代術后68天切口出現腫泡，切開引出淡黃色滲出液（培養無細菌生長），經清創再縫 合，傷口愈合外，其余所有病人切口均 1期愈合。病人術后3周，肢體關節開始 主動活動，逐漸恢復功能，腱張力均較強，無明顯沾連。其中210例詳細隨訪，隨訪時

40、間6個月至5年零8個月。根據Jenkins評定 功能標準，有效率97.6%,優良率90.6%。證實HHK人工腱具有組織相容性好， 對機體刺激小，無明顯抗原性，肌張力強，無明顯粘連，術后患肢功能恢復快等 特點。該產品安全、可靠、有效，能滿足臨床需要。青島大學醫學院附屬醫院鄒云雯等36，1996年4月至2001年8月，臨床應用HHK人工腱治療患者112例，其中男性81例，女 性31例，年齡1662歲，平均38歲。損傷原因：切割傷36例，牽拉傷40例， 砸壓傷36例。損傷部位：上臂叢神經損傷 20例，手肌腱斷裂5例，肱二頭肌肌 腱斷裂3例，腓總神經損傷致足下垂10例，跟腱斷裂25例，正中神經損傷2

41、例，橈神經損傷5例，膝關節側副韌帶損傷28例，交叉韌帶損傷14例。根據損 傷部位與性質，選用相應規格型號的 HHK人工腱行移植術或功能重建術。原則 上對肌腱缺損的病人行HHK人工腱移植修復術；對周圍神經損傷和關節韌帶損 傷的病人，行HHK人工腱功能重建術；對跟腱斷裂的病人，行 HHK人工腱“8” 字縫合加固術。在112例中，術后只有6例患者切開滲液（培養無細菌生長）， 換藥后切口愈合。經隨訪，采用 Jen ki ns標準進行療效評價：70例患者的功能恢 復為4級，39例患者的功能恢復為3級，只有3例患者的功能恢復為1級，有效 率97.3%。臨床試用結論：HHK人工腱具有良好的組織相容性，對人體

42、的刺激性 小，無明顯抗原性，術后患肢功能恢復好等特點。該產品安全、可靠、有效，能 滿足臨床需要。2.臨床推廣HHK人工腱這一科研成果轉化為產品后，先后在廣東、云南、山東、湖南、河 南、河北、廣西、天津等省市幾十家醫院，臨床應用一千余例。術后病人無發熱 等不良反應，傷口基本都能I期愈合。隨訪時間長達8年，功能恢復優良率在 90%以上，有效率97%以上。典型病例例116.男，21歲，槍彈擊傷右頸部，致右臂109HH人工腱重建術。術中將斜方肌叢神經完全斷裂傷，右三角肌、肱二頭肌完全癱瘓，抬肩、屈肘功能完全喪失； 右手腕、肌力、感覺完全正常。全麻下行 游離，以編織法將斜方肌連同肩峰 3cmK2cm 1

43、2人發角蛋白人工腱研究進展>2cm骨塊拉緊下移，一枚螺絲釘固定骨塊于肱骨上端，人工腱編織在三角肌止 點肌附著處。抬肩75度外展架制動6周。同時將同側胸大肌自肱骨上端止點上 剝離，以編織法人工腱固定，通過上臂皮下遂道固定在肱二頭肌腱在橈骨止點 處，屈肘60度位外展架固定。術后6周取除外固定架，即刻屈肘 30度，手可觸 及嘴唇、頭頂、抬肩170度。經功能練習可提3040斤重，屈肘、抬肩達正 常，功能十分滿意。半年取螺絲釘時，發現人工腱已完全腱化為正常肌腱，頭發 完全變為腱纖維。例 216.男，45歲。車禍致左上臂叢神經傷1年，左肩三角肌完全癱瘓，左肱二頭肌癱 瘓，肌力均為零級，抬肩屈肘功能完

44、全喪失。左手功能完好。肌電圖檢查，左腋 神經肌皮神經完全喪失傳導功能。在全麻下行左側背闊肌轉移，109HH人工腱編織在背闊肌肌腹，固定在三角肌止點，重建抬肩功能，又行胸大肌代替肱二頭 肌，人工腱重建屈肘功能。術后外展固定左上肢于抬肩75度，屈肘60度位。6周拆除固定，手可抬起并觸及頭頂。半年隨訪，抬肩、屈肘功能達正常，參加各 種農業勞動。例316.男，19歲。機器絞傷左手，致左手中、環、小指缺損，手掌部疤痕，屈肌腱缺損，食指屈肌腱缺損，伸180度，屈零度，被動活動各指間關節尚好。在臂叢麻醉下行109HH人工腱移植，屈食指肌腱重建術，術中以編織法固定于食指末節殘存屈深肌末端及腕上屈肌腱上。功能

45、位固定3周，逐漸練習屈伸功能。術后 3月隨訪屈指力量達5級，指尖距掌心 1cm，可對掌拿細小物，可提重物，恢復了手的大部分功能。例416.男，24歲。車禍致左膝關節外側副韌帶斷裂，左前交叉韌帶斷裂，左髕骨粉碎骨折3天入院。左髕骨骨折鋼絲內固定，109HH人工腱行前交叉韌帶重建術及外側副韌帶修復。術后4周不負重練習膝關節功能，3個月恢復原工作。上下坡、下蹲等活動自如，關節穩定，無腫痛，功 能十分滿意。例537.男，24歲，工人。騎摩托車摔傷右下肢，致右股骨中1/3開放性骨折；右膝髕韌帶完全斷裂。在他院常規對端縫合髕韌 帶，內固定股骨痊愈出院。右膝稍腫脹，浮髕試驗陰性，側方擠壓試驗陰性，抽 屜試驗

46、陰性，髕韌帶處明顯凹陷，膝 90°位不能伸，股四頭肌肌力0級，連續硬膜外麻醉下行右膝髕韌帶重建術。術中見髕 韌帶自脛骨結節上3cm處撕斷，斷端不整齊，并見多根縫線斷頭。伸直膝關節 后，兩斷端相距2cm，無法斷端對合縫合。于脛骨結節處用骨鉆打孔洞，并擴大 孔洞，同法在髕骨下級橫穿骨孔。以 HHK人工腱兩端各自從兩個洞內穿出，編 織固定，伸膝180。以韌帶膜或肌肉覆蓋人工腱。張力適中，沖洗傷口，關創， 包扎。術后傷口不紅腫，第10d部分拆線，12d完全拆線，傷口 I期愈合。3周開 始練習伸屈膝關節活動，6周逐漸下地行走負重。2個月復查，患膝可屈曲60。， 伸直達180°。3個月

47、查肌力達5級，上下樓梯自如，已恢復原工作。例638.男，30歲，工人。因車禍致右膝內側副韌帶斷裂，右脛骨平臺粉碎性骨折，在院外包草藥半個月入院。查體：右膝腫脹，外側張力試驗示右外側明顯松動不穩，活動受限。X線照片示：右脛骨平臺粉碎骨折（碎成4塊）。在硬膜外麻醉下，右脛骨以螺栓及鋼針固定，切除碎裂 之半月板。外側行HHK人工腱重建術。人工腱自股骨外上踝骨乳中突入又穿 出，編織縫扎，另一端自腓骨小頭骨孔中穿入翻回結扎牢固，縫合傷口。3周后床上練習屈伸膝關節，兩個月下地行走。隨訪1年，恢復開車，膝關節穩定性好。例738.男，23歲，工人。因車禍至左膝內外側副韌帶及前交叉韌帶斷裂，軟組織挫裂傷并左股骨

48、髁部粉碎骨折。傷后石膏托 固定20天轉入我院。檢查左膝中度腫脹，浮髕試驗陽性。股骨髁部壓痛，有骨 探音。張力試驗，左膝內側松弛。X線照片示：左股骨髁間粉碎骨折。硬膜外麻 醉下，行左股骨踝部以螺絲及鋼針固定，以 HHK人工腱重建前交叉韌帶及內側 副韌帶。人工腱的兩端均分別從股骨踝部及脛骨骨孔中穿出縫扎牢固。傷口引流 通暢，石膏托固定2個月。拆除石膏，在床上練習膝關節伸屈功能。隨訪半年， 骨折愈合好，膝關節伸屈180° 60。，張力試驗左膝內側不松動，左膝抽屜試驗陰 性。膝關節十分穩定，上下坡有力，恢復原工作，可騎摩托車。例839.男，40歲。因車禍至左膝內外側副韌帶斷裂，左前交叉韌帶斷

49、裂，左髕骨橫斷性閉合性人發角蛋白人工腱研究進展13骨折，左髖關節脫位，并股骨頭劈裂性骨折，左腓總神經癱3天入院。分期手術，除對左髖脫位及股骨頭劈裂行一次手術外，對髕骨折行鋼絲環形固定。以半 腱肌代前交叉韌帶，對膝內外側副韌帶行 HHK人工腱重建術。術后X線照片正 側位像顯示，脫位已整復，達到解剖復位。術后 3周進行不持重鍛煉膝關節。1 個月后，膝關節功能滿意，腓總神經功能恢復；膝關節內外側張力試驗，均為陰 性。抽屜試驗向前、向后拉時，膝關節無松動。加大膝關節內側、外側張力時， 膝關節無松動。膝關節自主屈曲、伸直自如。自主背伸、踝伸趾自如。自主趾踝 跖屈自如。3個月后復查，病人步態正常，膝關節穩

50、定，無關節腫脹，上下樓梯 自如，并可駕駛摩托車和汽車。例939.男，22歲。因車禍在當地醫院行清創、閉合傷口術后1個月后，感膝關節不穩而來我院就醫。經查發現右膝外側張力試 驗，膝外側松弛，示外側副韌帶斷裂。膝關節不穩，右膝小腿向后，示后交叉韌 帶斷裂。用HHK人工腱對右膝外側副韌帶、后交叉韌帶進行重建術。術后3個月復查，膝關節穩定，抽屜試驗和側向張力試驗均為陰性，步態正常。例 1039.男，25歲。因小兒麻痹后遺癥致左膝后屈肌群癱瘓，左膝反張15°行HHK人工腱固定術。術后功能滿意，4年后復查，未見拉應力衰減。例1139 .男性。因有外展拇長肌腱外傷后缺如2年而就醫，用HHK人工腱行

51、替代術。術后功能恢復滿意，隨訪 2年，未見拉應 力衰減。例1240.男，20歲。左拇指屈肌腱損傷，屈拇功能障礙。左拇指屈肌腱損傷缺如，在臂 叢麻醉下行HHK人工腱替代術。用編織法固定后，拇指可屈曲正常位。術后3周，主動練習屈伸活動。術后 4周，已恢復拇指的大部分功能。術后 3個月，拇 指屈、伸功能正常。例1340.男，21歲。車禍致左小腿跟腱部軟組織缺損，跟腱缺如。行HHK人工腱重建跟腱術及局部皮瓣轉移術。術后 2個 月，踝關節背伸、跖屈功能良好。術后 4個月，跟腱恢復正常功能。術后半年隨 訪，功能滿意，可打球、跳高、跑步，跟腱功能恢復與傷前無異。例1440.男，25歲。因小兒麻痹后遺癥致左側

52、膝關節后群肌癱瘓，左膝反張15°，行HHK人工腱固定術。術后功能滿意，半年 后隨訪，功能同術后，未見拉應力衰減，行走自如，上下樓梯等功能好。例1541.女，30歲，云南新平縣干部。因車 撞傷左膝關節后，行走無力，尤其下坡時經常跌跤，半年入院。查：左股四頭肌 明顯萎縮，抽屜實驗前拉松動。在硬膜外麻下行左膝關節探查術，發現左膝前交 叉韌帶斷裂。行HHK人工腱替代術，術中先于股骨外髁部前交叉韌帶附麗處向 脛前打骨洞，由內上經骨洞向脛前穿出，拉緊并用螺絲釘固定末端。長腿石膏托 固定膝關節功能位14天。術后傷口愈合良好，病人不發燒，無不適反應。第15天開始伸屈膝活動。第20天左膝伸180

53、76;下地行走步態良好，無松動情況，下 坡穩定。隨訪2年，完全恢復功能，股四頭肌萎縮消失。例1642.男，44歲，工人。右上臂舉重物時，突然劇烈疼痛，不敢活動5小時入院。病人既往身體健康。入院查體：神志清 醒，一般情況好，心、肺未見異常。右臂部明顯腫脹，壓痛，右肘關節活動受 限，屈肘肌力0級。各種實驗室檢查未見異常。診斷為右肱二頭肌長頭肌腱斷 裂。臂叢麻醉下行HHK人工腱移植術，以HHK人工腱橋接于右肱二頭肌肌腹與 右喙突之間，重建肱二頭肌屈肘功能。術后以石膏屈肘90。外固定。六周后拆除外固定，屈肘功能恢復，屈肘肌力達 4級以上。例1742.男，35歲，個體戶。騎摩托車摔傷 后，右臂外展、屈肘

54、不能一月入院。入院查體：神志清，一般情況好，心、肺未 見異常，左肩三頭肌萎縮，外展肌力 0級，肱二頭肌肌腹萎縮，屈肘肌力 0級。 各種實驗室檢查未見異常。入院診斷：左上臂叢根性撕脫傷。全麻下行HHK人工腱重建術。以斜方肌作為動力肌，將 HHK人工腱橋接于斜方肌與肱骨三頭肌 止點之間，重建肩外展功能；以胸大肌作為動力肌，將HHK人工腱橋接于胸大肌肱骨止點與尺骨肱二頭肌止點之間，重建屈肘功能。術后以石膏肩外展、屈肘 各90°外固定。6周后拆除外固定，肩外展、屈肘肌力均恢復到 4級以上。14人發角蛋白人工腱研究進展綜上所述，HHK人工腱不但克服了以往各種人工腱，包括自體腱和異體腱的不足 之

55、處，而且還兼具其所有優點，非常接近人們所期望的那種理想人工腱的要求：（1）組織相容性好，未發現抗原性，無發生局部和全身排斥反應；（2）植入后可被機體吸收，同時誘導形成新的自體腱；（3）腱的銜接部位能組織愈合，拉應力無明顯衰減，一般在6個月后可恢復到正常腱的功能；（4）可屈性和繞彎 性好，便于手術操作，并能保持良好的功能度；（5）未出現影響功能活動的粘 連，有良好的滑動性，無需行n期松解術；（6）產品包裝采用芬蘭 Wipak包裝 公司生產的Steriking透明式無菌包裝袋，經壓力蒸汽滅菌，無菌有效期長達60個月。安全可靠，運輸、貯存都很方便。四、HHK人工腱實質為HHK在體組織工程腱 組織工程

56、是運用細胞生物學和細胞 工程學的原理，構建修復和重建損傷的組織或器官替代物的一門學科。其核心是 把載體材料與相關組織或器官的功能細胞相融合，形成具有特定組織或器官功能 的生物代用品。種子細胞和可吸收生物性支架材料（細胞外基質）是構建修復和 重建損傷組織或器官替代物的兩個必備條件。要求種子細胞要有良好的組織相容 性，使之不被受體免疫系統排斥。同時還要解決好種子細胞在體外培養傳代擴增 過程中的老化和功能退化及變異的問題，使之不致喪失其特有功能；要求可吸收 生物性支架材料要有良好的生物相容性、生物親和力，使種子細胞能與之牢固粘 附，且能充分發揮細胞的功能。同時還要能控制其降解速率與細胞生長的同步 性

57、，降解產物的理化性能必須符合種子細胞生長環境的要求，最終形成新的功能 組織或器官取而代之。由于種子細胞取自同種異體或異種（遺傳修飾或未修飾），不可避免地在體內被 宿主排斥，而且其遺傳性狀或功能的改變是個潛在的危險。HHK人工腱在修復和重建損傷肌腱組織的過程中，較好地解決了這些問題：種子 細胞，成體干細胞（如腱形成細胞，滑膜前體細胞，間充質細胞）來自自體腱膜 下和損傷肌腱殘端組織內25，26;可吸收生物性支架材料，HHK人工腱具有良好的生物相容性、生物親和力13-15，其降解最終產物基本上全是氨基酸12，而且脯氨酸約占9 %，甘氨酸約占4%，正好就地取材，作為合成新生自體腱 膠原蛋白（脯氨酸約占20 %，甘氨酸約占30 %）的原料。其降解速率和抗拉強 度，可以通過對人發生物化學處理程序、程度的調整和改