1、微生物的分離和培養【考綱要求】 微生物的分離和培養 B 【復習要求】1.理解培養基對微生物的選擇利用并能利用選擇培養基分離微生物2.掌握培養微生物的過程、條件和方法3.掌握測量微生物數量的方法、統計菌落數量的方法4.能利用選擇培養基分離微生物的方法 【基礎知識】一、微生物的實驗室培養1培養基 （1）概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。（2）成分：一般都含有碳源、氮源、水和無機鹽，還需滿足不同微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。營養要素來源功能碳源無機氮源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳無機物構成細胞中的物質和一些代謝產物；既是碳源又是能源有機

2、碳源糖類、脂質、蛋白質、有機酸、石油、花生粉餅等氮源無機氮源無機氮：NH3、銨鹽、硝酸鹽、N2等將無機氮合成含氮的代謝產物有機氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白質、核酸及含氮的代謝產物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶和核酸的組成成分；參與代謝過程中的酶促反應（3）分類和應用劃分標準培養基種類特點用途物理性質液體培養基不加凝固劑工業生產半固體培養基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運動、分類、鑒定 培養基微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種化學成分 培養基含化學成分不明確的天然物質工業生產 培養基培養基成分明確(用化學成分已知的化學物質配成)分類、鑒定用途 培養基培養基中加入某種化學物質，以

3、抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長培養、分離出特定微生物(如培養酵母菌和霉菌，可在培養基中加入 ；培養金黃色葡萄球菌，可在培養基中加入高濃度 ) 培養基根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類的微生物，如可用添加 的培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤)2無菌技術 消毒和滅菌的區別條件結果常用方法應用范圍消毒較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部的部分對人有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法牛奶等化學藥劑、物理消毒法用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源；紫外線消毒滅菌強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，

4、包括芽孢和孢子灼燒滅菌法接種工具_滅菌法玻璃器皿、金屬工具_滅菌法培養基及容器的滅菌三種常用滅菌方法的比較滅菌方法適用材料或用具滅菌條件滅菌時間灼燒滅菌接種環、接種針、涂布器或其他金屬工具酒精燈火焰的充分燃燒層直至燒紅干熱滅菌玻璃器皿(吸管、培養皿)和金屬用具等干熱滅菌箱內， 1 h2 h高壓蒸汽滅菌培養基等高壓蒸汽滅菌鍋內 kPa， 15 min30 min3實驗操作(1)牛肉膏蛋白胨固體培養基的制備計算稱量熔化滅菌倒平板。(2)微生物的分離方法： 劃線法 平板法微生物的計數方法： 方法平板劃線法稀釋涂布平板法注意事項(1)接種環的灼燒：第一次劃線前：接種環上的微生物，避免污染培養物每次劃線

5、前：殺死殘留菌種，保證每次劃線菌種來自_劃線末端劃線結束后：殺死殘留菌種，避免污染環境和感染操作者(2)灼燒接種環之后，要_后再進行操作，以免溫度太高殺死菌種(3)劃線時最后區域不要與第_區域相連(4)劃線用力要大小適當，防止用力過大將培養基_。(1)稀釋操作時：每支試管及其中的9 mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應離火焰12 cm處(2)涂布平板時：涂布器用體積分數為70%酒精消毒，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精酒精燈與培養皿距離要合適，移液管管頭不要接觸任何物體目的在培養

6、基上形成由單個菌種繁殖而來的子細胞群體菌落培養平板冷凝后 培養，使培養基表面的水分更好地揮發，防止皿蓋上水珠落入培養基造成污染。二、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數1分離原理：土壤中細菌之所以能分解尿素，是由于它們體內能合成脲酶 ，這種物質在把尿素分解成無機物的過程中 起到催化作用。2菌種篩選：使用_是唯一氮源的_培養基培養。3統計菌落數目：常用方法有 、顯微鏡直接計數法。直接計數法：這種方法是利用血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。此法的缺點是不能區分死菌與活菌。（但用亞甲基藍染色后，死細胞是藍色，活的是無色的）間接計數法(活菌計數法)：稀釋涂布平板法，常用來統計樣品中

7、的活菌數。此法是根據微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現象進行的。4實驗流程：土壤取樣制備培養基微生物的培養與觀察細菌的計數。5觀察記錄結果：每克土壤樣品菌數某稀釋倍數的菌落平均數×稀釋倍數。思考：如何進行系列稀釋？某稀釋倍數指哪一個倍數？計算值和真實值之間的關系？為什么？6.鑒定方法：在培養基中加入酚紅指示劑， 若pH升高，指示劑變 ，說明細菌能分解尿素。三、分解纖維素的微生物的分離1纖維素酶：一種復合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。2纖維素分解菌的篩選原理 剛果紅可以與纖維素形成紅色復

8、合物，但并不和二糖和葡萄糖發生這種反應。纖維素分解菌能產生纖維素酶分解纖維素，從而使菌落周圍形成透明圈。3. 篩選方法：(1) 鑒定方法： 染色法，即通過是否產生_來篩選纖維素分解菌。(2) 篩選：以 為唯一碳源的選擇培養基。4土壤中纖維素分解菌的篩選實驗流程土壤取樣（富含 的環境）選擇培養（用_培養基培養，目的是增加纖維素分解菌的數量）梯度稀釋涂布平板（將樣品涂布到_纖維素分解菌的培養基上）挑選產生 的菌落（產生纖維素酶的菌落周圍出現 ）?！玖曨}鞏固】1.不同的微生物對營養物質的需要各不相同。下列有關一種以CO2為唯一碳源的自養微生物營養的描述中，不正確的是()。A氮源物質為該微生物提供必要

9、的氮素B碳源物質也是該微生物的能源物質C無機鹽是該微生物不可缺少的營養物質D水是該微生物的營養要素之一2.如右圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序為1、2、3、4、5。下列操作方法正確的是( )。A操作前要將接種環放在火焰旁滅菌B劃線操作須在火焰上進行C在5區域中才可以得到所需菌落D在1、2、3、4、5區域中劃線前后都要對接種環滅菌3.用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確的是()。A涂布了一個平板，統計的菌落數是230B涂布了兩個平板，統計的菌落數是215和260，取平均值238C涂布了三個平板，統計的菌落數分別是21、212

10、和256，取平均值163D涂布了三個平板，統計的菌落數分別是210、240和250，取平均值2334.可以鑒定出分解尿素的細菌的方法是( )。A以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑B以尿素為唯一氮源的培養基中加入二苯胺試劑C以尿素為唯一氮源的培養基中加入蘇丹試劑D以尿素為唯一氮源的培養基中加入雙縮脲試劑5.通過選擇培養基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在缺乏氮源的培養基上大部分微生物無法生長；在培養基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌；在培養基中加入10%的酚可以抑制細菌和霉菌。利用上述方法能從混雜的微生物群體中分別分離出( )。大腸桿菌霉菌放線菌固氮細菌A B C D6.培養基

11、、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌或消毒方法依次是 ( )化學消毒灼燒滅菌干熱滅菌紫外線消毒高壓蒸汽滅菌巴氏消毒法A B C D7.下列關于微生物分離和培養的有關敘述，錯誤的是（ ）A. 微生物培養前，需對培養基進行消毒B. 測定土壤樣品中的細菌數目，常用菌落計數法C. 分離土壤中不同的微生物，要采用不同的稀釋度D. 分離能分解尿素的細菌，要以尿素作為培養基中唯一的氮源8.用平板劃線法或稀釋涂布平板法純化大腸桿菌時（ ）可以用相同的培養基 都需要使用接種針進行接種都需要在火焰旁進行接種 都可以用來計數活菌A B C D9. “篩選”是分離和培養生物新類型常用的手段，下列

12、有關技術中不能篩選成功的是A在全營養的LB培養基(普通培養基)中，篩選大腸桿菌B在尿素固體培養基中，篩選能夠分解尿素的微生物C用纖維素為唯一碳源的培養基，篩選能分解纖維素的微生物D在培養基中加入不同濃度的氯化鈉，篩選抗鹽突變體植物10.可以鑒定出分解尿素的細菌的方法是( )A以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑B以尿素為唯一氮源的培養基中加入二苯胺試劑C以尿素為唯一氮源的培養基中加入蘇丹試劑D以尿素為唯一氮源的培養基中加入雙縮脲試劑11.（2013江蘇卷,18）某研究小組從有機廢水中分離微生物用于廢水處理。下列敘述正確的是（ ）A. 培養基分裝到培養皿后進行滅菌B. 轉換劃線角度后需灼燒接

13、種環再進行劃線C. 接種后的培養皿須放在光照培養箱中培養D. 培養過程中每隔一周觀察一次12.（2014江蘇30）為了獲得ß-胡蘿卜素產品,某小組開展了產ß-胡蘿卜素酵母的篩選與色素提取實驗。 請回答下列問題:(1)實驗用的培養皿常用的兩種滅菌方法是 ;為了減少滅菌后器皿被污染,滅菌前應該 。(2)為了篩選出酵母菌,培養基中添加了青霉素,其目的是 。(3)右圖是滅菌鍋及其局部剖面示意圖,圖中甲、乙、丙指示的依次是 。 (填序號)安全閥、放氣閥、壓力表放氣閥、安全閥、壓力表安全閥、放氣閥、溫度表放氣閥、安全閥、溫度表(4)為了將分離到的菌株純化,挑取了菌落在 3 塊相同平板上

14、劃線,結果其中一塊平板的各劃線區均未見菌生長,最可能的原因是 。(5)為增加ß-胡蘿卜素提取量,在研磨酵母細胞時,添加石英砂的目的是 ;研磨時 (填“需要”或“不需要”)添加 CaCO3,理由是 。13.（2015江蘇31）人工瘤胃模仿了牛羊等反芻動物的胃,可用來發酵處理秸稈,提高秸稈的營養價值。為了增強發酵效果,研究人員從牛胃中篩選纖維素酶高產菌株,并對其降解纖維素能力進行了研究。請回答下列問題: (1)在樣品稀釋和涂布平板步驟中,下列選項不需要的是 _ (填序號)。 酒精燈 于培養皿 顯微鏡 無菌水 (2)在涂布平板時,滴加到培養基表面的菌懸液量不宜過多的原因是 。 (3)向試管

15、內分裝含瓊脂的培養基時,若試管口粘附有培養基,需要用酒精棉球擦凈的原因是 。 (4)剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物,但并不與纖維素降解產物纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。研究人員在剛果紅培養基平板上,篩到了幾株有透明降解圈的菌落(見右圖)。 圖中降解圈大小與纖維素酶的 有關。 圖中降解纖維素能力最強的菌株是 (填圖中序號)。 (5)研究人員用篩選到的纖維素酶高產菌株J1和J4,在不同溫度和pH條件下進行發酵, 測得發酵液中酶活性的結果見下圖,推測菌株 _ 更適合用于人工瘤胃發酵,理由是 。 14.尿素是一種重要的農業肥料，但若不經細菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數

16、量繁多，同學們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌(目的菌)。培養基成分如下表所示，實驗步驟如圖所示。請分析回答問題：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO4·7H2O0.2 g葡萄糖10 g尿素1 g瓊脂15 g將上述物質溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL (1)此培養基能否用于植物組織培養？_，理由是_。(2)培養基中加入尿素的目的是篩選_，這種培養基屬于_培養基。(3)“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養基中的_和_，實驗需要振蕩培養，原因是_。(4)轉為固體培養時，常采用_的方法接種，獲得單菌落后

17、繼續篩選。(5)下列材料或用具中：培養細菌用的培養基與培養皿；玻棒、試管、錐形瓶和吸管；實驗操作者的雙手。需要滅菌的是：_；需要消毒的是：_(填序號)。(6)在進行分離分解尿素的細菌的實驗時，A同學從培養基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只選擇出大約50個菌落。A同學的實驗結果產生的原因可能有_(填序號)。由于土樣不同由于培養基污染由于操作失誤沒有設置對照(7)簡述土壤中可分解尿素的細菌的鑒定方法及原理：_微生物的培養與應用【基礎知識】一、微生物的培養1.固體 天然 合成 選擇 青霉素 食鹽 鑒別 伊紅美藍2.干熱 濕熱（高壓蒸汽） 160 170 100 121 3.平板劃線法 稀釋涂布

18、平板法 稀釋涂布平板法上次 冷卻 第一 劃破 倒置二、2.尿素 選擇3.稀釋涂布平板法5.配置5ml溶液，取0.5ml溶液注入含4.5ml無菌水的試管中，以此類推，最后試管吸取走0.5ml.（或者1:9）一般選取菌落數為30300的一組計算值比真實值小，因為可能多個個體形成一個菌落6.紅三、3.剛果紅 透明圈 纖維素4.維生素 選擇 鑒別 透明圈 透明圈【習題鞏固】1. 【答案】B 【解析】以CO2為唯一碳源可知該微生物為自養型微生物，可以利用CO2合成有機物，該無機碳源不能為微生物提供能量，其能源來自于光能或分解有機物釋放出的化學能。2. 【答案】D【解析】在每次劃線前后都要對接種環進行滅菌

19、，接種環的滅菌方法是在火焰上灼燒，接種時劃線操作是在火焰旁進行。在5個區域中，只要有單個活細菌，通過培養即可獲得所需菌落。3. 【答案】D【解析】在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性，所以A、B不正確。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數結果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，此時，不能簡單地將3個平板的計數值用來求平均值。4. 【答案】A【解析】在以尿素為唯一氮源的培養基中，不能分解尿素獲得氮源的細菌不能生長，而分解尿素的細菌能利用尿素作氮源，將尿素分解為氨，使pH升高。若培養基中加入酚紅指示劑，指示劑將變紅。此培養基既屬于選擇

20、培養基，又屬于鑒別培養基。5. 【答案】A【解析】缺乏氮源的培養基上大部分微生物無法生長，而固氮細菌能生長；在培養基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌，霉菌能生長；在培養基中加入10%的酚可以抑制細菌和霉菌，放線菌能生長。6. 【答案】A【解析】培養基用高壓蒸汽滅菌；培養皿耐高溫，需用干熱滅菌；接種環可用灼燒滅菌達到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養成分可采用巴氏消毒法。7. 【答案】A【解析】微生物培養前，需對培養基進行滅菌，而不是消毒；單個細菌時肉眼看不見的，肉眼可見的是群落，因此測定土壤樣品中的細菌數目，常用菌

21、落計數法而一般不用活菌數計數；分離土壤中不同的微生物，要采用不同的稀釋度以便能從中選擇出菌落數在30-300間的平板進行計數；能分解尿素的細菌，可以利用尿素為氮源，其它微生物不能，故分離能分解尿素的細菌時，要以尿素作為培養基中唯一的氮源。8. 【答案】C【解析】平板劃線法或稀釋涂布平板法都使用固體培養基，故正確；平板劃線法采用接種針進行操作，而稀釋涂布平板法采用涂布器進行操作，故錯誤；純化時，要進行無菌操作，需要在火焰旁接種，避免空氣中的微生物混入培養基，故正確；平板劃線法一般用于分離而不是計數，故錯誤。9. 【答案】A【解析】全營養的LB培養基(普通培養基)上可生長多種細菌，篩選不到純的大腸桿菌。10. 【答案】A【解析】在以尿素為唯一氮源的培養基中，不能分解尿素獲得氮源的細菌不能生長，而分解尿素