1、PETPET原核表達系統原核表達系統pET系統是有史以來在E.coli中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統。目的基因被克隆到pET質粒載體上。受噬菌體T7強轉錄及翻譯信號控制，表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白。不依賴連接反應的克隆方法（LIC） 用LIC法制備的pET載體有不互補的單鏈粘端，與目的插入片段上相應的粘端互補。擴增目的插入片段的引物5,端序列要與LIC載體互補。T4DNA聚合酶的3 , -5 , 外切酶活性經短時間即可在插入片段上形成單鏈粘端。由制備好的插入片段和載體互相形成退化產物，

2、這種方法十分快速高效且為定向克隆。pET載體上編碼的氨基酸序列可通過腸激酶或X因子去掉。Function of T7 Polymerase The 35 exonuclease activity of T4 DNA polymerase removes nucleotides until it encounters a residue corresponding to the single dNTPpresent in the reaction mix. At this point the 53 polymerase activity of the enzyme counteractsthe

3、exonuclease activity to effectively prevent further excision.pET載體 pET載體最初是由Studier及其同事構建。 (Studier and Moffatt,1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990). 包括兩種載體轉錄載體（用于表達本身含有核糖體結合位點和起始密碼子目的基因）和翻譯載體（載體上帶有核糖體結合位點）。一般來說，轉錄載體用于表達來自原核的基因，而翻譯載體表達真核基因。抗生素抗性 pET載體常用的兩種篩選標記是Ampr+和Knar+ 因為內酰胺酶的消化和PH

4、的降低，Ampr+的選擇性易于丟失。某種情況下使用Knar+更為有利。 Ampr+和Knar+的另一個不同是兩種基因的轉錄方向不同 。Ampr+位于T7啟動子下游，與其方向相同。除了pET5系列，T7轉錄終止序列位于內酰胺酶基因前面，但是這個終止序列只有70%的有效性。因此，T7聚合酶能夠通讀，導致內酰胺酶的積累。相反Knar+的轉錄方向與T7啟動子方向相反，誘導時并沒有Knar+基因的增加。 用于克隆的宿主菌 用于克隆的宿主菌通常是Novablue，JM109以及DH5a。這些菌株是rec-end-型，轉化效率高，且質粒產量也高，適合用于保存帶有克隆目的基因的PET載體。用于表達的宿主菌 B

5、L21(DE3) 基因型： F ompT hsdSB (rB mB) gal dcm (DE3) 無抗性 重組質粒轉化到帶有T7RNA聚合酶基因 的大腸桿菌中，即可開始產生蛋白了。這些菌株都是DE3溶原菌。噬菌體DE3是一種衍生噬菌體，帶有噬菌體21抗性區和lacI基因，lacUV5啟動子，以及T7RNA聚合酶基因。這一區段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出，一旦形成DE3溶原狀態，就只有受IPTG誘導的lacUV5啟動子指導T7RNA聚合酶基因轉錄。BL21(DE3) BL21(DE3)是應用最廣泛的表達宿主菌。是lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶

6、（純化過程可以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更加穩定。 因為BL21(DE3)對利福平敏感，如果有必要可以用利福平來限制宿主RNA和蛋白質的背景合成。 應該注意一些帶有T7啟動子的商業載體原則上可以用來表達，然而，只有T7啟動子而沒有額外的lac阻遏子基因的載體并不適合。這些載體上的多拷貝lac操縱 子（用于藍白斑篩選）會結合lac抑制因子，使pet菌株中同樣受lac抑制因子控制的基因部分表達。結果基本的T7RNA聚合酶活性升高，使目的基因的穩定性受到影響。lacUV5 Promoter 與野生型lac啟動子相比，控制T7RNA聚合酶表達的 lacUV5啟動子對 cAMP/CRP的刺激并

7、不敏感。然而，最近研究發現rDE3宿主菌在缺少葡萄糖的培養基生長到穩定期時，cAMP同樣對lacUV5產生了去阻遏作用。盡管宿主菌長到穩定期并不推薦，菌體培養過夜（16h）后轉入含有1%的葡萄糖的培養基中，可以有效避免去阻遏作用，因為glucose可以cAMP的產生。T7lac Promoter T7啟動子下游有個Lac啟動子，它包含常規的啟動子和lacI基因，T7lac與lacI啟動子位置交錯。采用這種載體及DE3溶原菌，lac阻遏蛋白可以作用與T7RNA聚合酶，也作用與載體T7lac啟動子。阻斷任何T7RNA聚合酶導致的目的基因轉錄。pLysS和pLysE宿主菌 另一個為目的基因提供穩定性

8、保證的方法是在擁有兼容的氯霉素抗性編碼表達少量T7溶菌酶（T7RNA聚合酶天然抑制物）的宿主中表達。 T7RNA溶菌酶是一種雙功能蛋白，它能夠切割大腸桿菌細胞壁肽聚糖層，也可與聚合酶結合，阻止轉錄。pLysS (or pLysE）有助于目的蛋白的抽提 The presence of pLysS (or pLysE) has the further advantage of facilitating the preparation of cell extracts. After the target protein has accumulated, the cells are collected

9、 and suspended in a buffer such as 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.0. Simply freezing and thawing, or adding 0.1% Triton X-100, will allow the resident T7 lysozyme to efficiently lyse the cells. This property can make it advantageous to carry pLysS in the cell even when it is not required for stabil

10、izing the target plasmid.載體與宿主共同影響表達水平 實際操作中，通常要嘗試多種不同的載體/宿主菌組合以期獲得擁有正確結構的目的蛋白的高水平表達。The pET System Process Prepare pET Vector Prepare Insert DNA Clone Insert into pET Vector Transform into Expression Host Induce and Optimize Expression of Target Protein Scale-up Purify Target Protein PCR法制備插入片段有引入突

11、變的風險，可以采用以下方法降低PCR反應的突變： 采用高保真的酶 減少循環數 增加模板濃度 增加引物濃度片段與載體連接 For a standard reaction using DNA fragmentswith 24 base sticky ends, use 50-100 ng(0.0150.03 pmol) of pET vector with 0.2 pmol insert (50 ng of a 500 bp fragment) in avolume of 20l.Assemble the following components in a 1.5 ml tube (these c

12、omponents are available separately in the DNA Ligation Kit, Cat. No. 69838-3). Add the ligase last.1.接菌于LB液體培養基，搖過夜.2.取1.5ml于EP管，12,000 g離心1min.徹底去除上清.3.用100ul solutionI懸浮菌體. 4.加200ul新鮮配制的0.2 N NaOH, 1% SDS，顛倒混勻，冰上放置3min.5.加150ul150 l of ice-cold 3 M NaOAc, pH 5.2。顛倒混勻，冰上放置5min。6.12000rpm，離心5min。轉移上

13、清到一個新的Ep管。7.加400 l TE-buffered phenol:chloroform:isoamyl alcoho(25:24:1)，渦旋震蕩30s。8.12,000 g for 5 min at 4C.9.倒掉上清，加400ul乙醇。10.重懸沉淀，30ul含20ug/mlRNAse的TEbuffer。37放置15min。 質粒小量制備solutionI（ice-cold 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mMEDTA預冷）表達宿主菌的誘導For pET constructions carrying the “plain” T7 p

14、romoter, a final concentration of 0.4 mM IPTG is recommended, while 1 mM IPTG is recommended with vectors having the T7lac promoter. An準備誘導表達 Pick a single colony from a freshly streaked plate and inoculate 50 ml LB containing the appropriate antibiotic in a 250 ml Erlenmeyer flask. (For good aerati

15、on, add medium up to only 20% of the total flask volume.)另一種誘導方法 Alternatively, inoculate a single colony or a few microliters from a glycerol stock into 2 ml LB medium containing the appropriate antibiotic. Incubate with shaking at 37C until the OD600 reaches 0.61.0. Store the culture at 4C overnig

16、ht. The following morning, collect the cells by centrifugation (30 sec in a microcentrifuge). Resuspend the cells in 2 ml fresh medium plus antibiotic and use this to inoculate 50 ml medium.誘導的步驟1.37搖床培養到OD6000.4-0.1（建議OD600為0.6）約3個小時可達到.2.從中取出一些樣品作為未誘導對照及滴度測試。在剩下的樣品中加入100mMIPTG儲液至終濃度0.4（T7啟動子）或1mM（

17、T7lac啟動子），繼續培養2-3小時。3.將搖瓶冰上放置5min，5000g4離心。如果需要收集上清進行進一步分析。4.重懸細胞于0.25倍體積預冷的20mMTris-Hcl（PH8.0）中離心。5.出去上清，菌體保存于-70冰箱或繼續純化。優化表達條件質粒穩定性測試 平板1：10-6稀釋在瓊脂板 。結果，所有細胞都生長。平板2：10-6稀釋在含抗生素平板。結果只有攜帶質粒細胞生長。平板3：10-5稀釋在含IPTG平板。結果，只有質粒已丟失或無法表達的目的基因的細胞能生長。平板4：10-5稀釋在含1mMIPTG和抗生素平板。結果，只有仍攜帶質粒但已失去表達目的基因能力的細胞能生長。IPTG將

18、阻止任何帶有T7RNA聚合酶誘導基因和功能目的質粒的細胞形成菌落。III，IV不適用于pLysS，pLysE質粒和T7lac啟動子。優化表達條件 The optimal scheme and time course for induction can vary, because the characteristics of each target gene product are unique.Example：37生長常常會導致一些蛋白質積累形成包涵體，而30生長則可能產生有活性的蛋白。如果想利用一些pET載體中的信號肽序列輸出蛋白的話，在25或30生長和培養可能是最優化的。在某些情況下，低溫

19、（15-20）延長誘導時間（過夜）可以使溶解性蛋白產量達到最大。優化表達條件 裂解緩沖液 裂解緩沖液的性質會大大影響到目的蛋白可溶與不溶之間的比例。當采用一般的裂解緩沖液如1His Bind Binding（包括500mM）緩沖液時，一些包含疏水或膜相關結構域的蛋白可能被歸于不容部分，但并不出現在包涵體中。在裂解緩沖液中加入毫摩爾的非離子型或雙性去污劑可以將由于細菌脂或膜結合而不容的蛋白組分轉變為可溶組分。BugBuster蛋白抽提試劑或PopCulture與rLysozyme一起使用，是使蛋白溶解的理想選擇。非離子型和雙性去污劑能夠溶解細胞壁和膜組分，因此，無需變性就可以釋放出胞內蛋白。優化

20、表達條件 包涵體的形成有利于純化，因為：F 通過離心可以很容易的獲得高產量而且比較純的蛋白。F包涵體的形成可以避免蛋白受到蛋白酶的降解。F有毒蛋白以包涵體形式存在，可以避免其對細胞生長的抑制。 近些年來，包涵體的解折疊的方法學上取得了很大的進步。報道了很多解折疊方案，不同的目的蛋白的解折疊方案不同，主要是根據經驗來決定。蛋白質解折疊試劑盒提供了一套試劑，能很方便的促進一些蛋白的重折疊。優化表達條件 二硫鍵的形成 pET-32, pET-39 and pET-40 溶解性可以通過選擇載體，克隆位點或是宿主菌來調控。例如，pET-32系列載體產生硫氧還蛋白的融合蛋白，可以增加胞質中可溶蛋白的產量。

21、AD494或BL21trxB菌株可以在胞質中形成二硫鍵。 If your target protein contains one or more essential disulfide bonds, the combination of a pET-32 vector and a trxBhost may prove to be optimal because disulfide bond formation in the cytoplasm appears to bedependent on the presence of thioredoxins (Stewart et al., 1998

22、).優化表達條件 蛋白質在細胞周質中易于形成二硫鍵，利于蛋白質的折疊。與胞質中不同，大腸桿菌細胞周質是一個氧化的環境，含有催化二硫鍵形成的酶。要想得到正確折疊，有活性的含二硫鍵的目的蛋白，一個常用的策略就是，將異源蛋白運輸到細胞周質中。一般來說，通過目的基因與號肽基因融合，可以使表達蛋白定位于周質。注意：過表達的DsbC酶是以氧化形式存在的，必須暴露在還原試劑中（0.1-1.0mMDTT）在體外才表現出二硫鍵異構酶的活性。Typically, a DsbC fusion protein expressed from pET-40b(+) is first purified by HisBind

23、 chromatography. Prior to exposing the fusion protein to a reducing agent, either EDTA should be added to a final concentration of 1 mM, or the sample should be dialyzed to remove residual Ni2+.影響目標蛋白穩定性的N端原則 Another factor that appears to influence target protein stability is the amino acid immedia

24、tely following the N-terminal methionine (penultimate amino acid). The amino acid at this position determines the removal of N-terminal fMet. Processing is catalyzed by methionyl aminopeptidase and is governed by the following relationship: the degree of removal decreases as the size of the penultim

25、ate amino acid side chain increases (Hirel et al., 1989; Lathop et al., 1992). In practice, little or no processing was observed by these authors when the following amino acids occupied the penultimate position: His, Gln, Glu, Phe, Met, Lys, Tyr, Trp, Arg. Processing ranged from 16%97% when the rema

26、ining amino acids occupied this position. Tobias et al. (1991) have determined the relationship between a proteins amino terminal amino acid and its stability in bacteria, i.e., the N-end rule. They reported protein half-lives of only 2 minutes when the following amino acids were present at the amin

27、o terminus: Arg, Lys, Phe, Leu, Trp, and Tyr. In contrast, all other amino acids conferred half-lives of 10 hours when present at the amino terminus in the protein examined.Leu in the penultimate position would be a poor choice！ 有時除了全長目的蛋白還會發現未完全表達的截短蛋白，一個顯見的解釋就是蛋白降解，而次翻譯起始位點是另一種可能。若一個類似核糖體結合位點（AAGG

28、AAG）的序列加上適當的間隔序列（一般是5-13個核苷酸），位于AUG密碼子上游，會發生上述情況。一個可能的解決方法是采用pET載體，可以在兩端都有融合標簽。其他影響表達水平的因素 mRNA轉錄產物的二級結構。 意外的終止密碼子。 轉錄終止子。 不穩定目的mRNA及蛋白。Function of T7 Polymerase The 35 exonuclease activity of T4 DNA polymerase removes nucleotides until it encounters a residue corresponding to the single dNTPpresent in the reaction mix. At this point the 53 polymerase activity of the enzyme counteractsthe exonuclease activity to effectively prevent further excision. 用于克隆的宿主菌 用于克隆的宿主菌通常是Novablue，JM109以及DH5a。這些菌株是rec-end-型，轉化效率高，且質粒產量也高，適合用于保存帶有克隆目的基因的PET載體