1、西安交通大學醫學院免疫教研室二00四年一月主編:劉如意主審:袁育康 范桂香參編：謝 明 王軍陽 周曉勃 雷艷君 任會勛 史 霖 醫學免疫學 實習指導目錄免疫學實驗的目的和要求2實驗室規則2第一篇 非特異性免疫檢測3實驗一 血腦屏障作用3實驗二 吞噬細胞的功能試驗4實驗三 溶菌酶的溶菌作用7實驗四 血清總補體活性測定（CH50單位測定）9第二篇 特異性體液免疫檢測11實驗五 凝 集 反 應11實驗六 沉淀反應17實驗七 補體結合反應25實驗八 中和實驗（ Neutrlization test ）29實驗九 免疫標記技術33實驗十 免疫血清的制備及效價測定40實驗十一 體外抗體形成細胞檢查法（溶血

2、空斑實驗 PFC）43第三篇 細胞免疫檢測46實驗十二 E-玫瑰花環形成實驗46實驗十三 淋巴細胞轉化實驗48第四篇：免疫病理反應52實驗十四 豚鼠速發型過敏反應52實驗十五 免疫復合物型超敏反應53實驗十六 豚鼠結核菌素試驗55實驗十七 小鼠 DNFB 試驗5659免疫學實驗的目的和要求 每次實驗前必須做好預習，明確本次實驗的目的、內容、操作要點和相關的理論知識。 進入實驗室必須嚴格遵守實驗室規則。 實驗中聽從老師指導，依照三嚴（嚴肅、嚴格、嚴密）要求進行實驗，做好實驗記錄。 認真觀察分析實驗結果,寫出實驗報告。實驗中遇到的有關問題,用科學的態度總結探討其原因,培養分析問題和解決問題的能力。

3、實驗室規則 進入實驗室必須穿好白大衣。 除實驗中必須的學習用品外，不要放實驗臺上。 實驗室內不允許吃食品、飲水，嚴禁吸煙。 實驗中一定要保持實驗室安靜，不要大聲喧嘩，嚴禁打鬧。 實驗要按老師要求操作，如發現問題要及時報告指導老師。 愛護實驗器材，如有損壞應及時報告老師，需賠償者按規定辦理。 實驗完畢要清理臺面，需沖洗者按要求沖洗，需收回者按要求擺放整齊收回。 離開實驗室時，一定要有專人負責關好門窗、水源及照明設備。第一篇 非特異性免疫檢測實驗一 血腦屏障作用基本原理 血腦屏障由軟腦膜、脈絡叢的毛細血管壁和包在壁外的神經膠質細胞形成的膠質膜構成，起著天然的屏障作用，可以阻擋病原微生物及毒性產物、

4、異物顆粒包括染料顆粒等從血流進入腦組織和腦脊液內，從而保護中樞神經系統免受損害。實驗材料2只小鼠 。 1ml無菌注射器（配4號針頭）。 5%臺盼藍水溶液。生理鹽水 0.1ml。 眼科剪子和鑷子等。實驗方法 用 1ml無菌注射器吸取5%臺盼藍水溶液經尾靜脈注入兩只小鼠體內，每只0.7ml，更換注射器，給其中一只小鼠顱內注射生理鹽水0.1ml。 5-10分鐘后觀察小鼠皮膚，尤其是眼、嘴的顏色變化。 于 30-60分鐘，見小鼠眼、嘴呈現藍色，即窒息死亡，腹部向下固定。 由頭到尾沿背中線剪開皮膚，暴露皮下、肌肉和內臟，觀察顏色變化。 小心剖開顱骨和椎骨，暴露腦和脊髓，與皮下、肌肉及內臟比較；并比較 2

5、只小鼠有何不同。實驗結果未經顱內注射的小鼠，眼、耳、鼻皮下及肌肉均呈現明顯的藍色，但腦、脊髓均未變色；而經顱內注射的小鼠上述部位可呈現明顯的藍色。注意事項 臺盼藍水溶液要經過濾后方可使用。 尾靜脈注射要從遠斷進針；如推注容易，表明進入了血管；如引起皮下凸起或發白，說明未進入了血管；拔出針頭，從稍近斷進針。（謝 明）實驗二 吞噬細胞的功能試驗巨噬細胞能吞噬雞紅細胞、中性粒細胞可吞噬多種細菌，如葡萄球菌等。將巨噬細胞和中性粒細胞分別與雞紅細胞、表皮葡萄球菌混合，孵育一定時間后涂片染色鏡檢；見巨噬細胞可吞噬雞紅細胞；中性粒細胞可吞噬葡萄球菌，可計算出吞噬異物的細胞數和吞噬細胞中吞入的異物數。在巨噬細

6、胞中亦可見到雞紅細胞發生形態改變。具此可判斷兩類吞噬細胞的吞噬功能和消化功能，用以評價機體的免疫狀態。實驗目的證實吞噬細胞的吞噬作用。了解機體的非特異免疫防護作用。一、 豚鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用測定（大吞噬） ：基本原理淀粉可以刺激豚鼠腹腔引起非感染性炎癥滲出，在腹腔局部出現較多巨噬細胞，巨噬細胞則能吞噬注入腹腔的雞紅細胞等較大異物。實驗材料 實驗動物：豚鼠 雞紅細胞懸液：從雞翼下靜脈或心臟取血，按 1 : 5比例保存于Alsever氏保養液中，放4 C°冰箱可用1個月，用前將雞紅細胞用生理鹽水洗3次，第3次洗滌 2000r/min,5min，棄上清，壓積細胞用生理鹽水配制為5%雞紅

7、細胞懸液，供大吞噬試驗用。 5%淀粉肉湯溶液、姬姆薩染液、玻片、注射器等。實驗方法 取無菌 5%淀粉肉湯溶液5ml注入豚鼠腹腔，常規飼養三天；實驗前1小時再次注入豚鼠腹腔無菌5%淀粉肉湯溶液5ml，然后注射5%雞紅細胞懸液5ml，輕揉其腹部，使雞血球均勻分布。 在注射后 30分鐘、1小時、2小時、3小時、分別用注射器抽取豚鼠腹腔液推片。 自然干燥后，姬姆薩染色，油鏡觀察。實驗結果計算 100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數目及被吞噬的雞紅細胞的總數，并觀察雞紅細胞的消化程度，按下列公式計算吞噬百分比和吞噬指數。吞噬百分比 =× 100% 吞噬指數 = × 100%雞紅細

8、胞被消化的程度分 4級：級：未消化，胞質淺紅或淺黃，胞核淺紫紅色。級：輕度消化，胞質淺黃綠色，核固縮，成紫藍色。級：重度消化，胞質淡染，胞核呈淺灰黃色。級：完全消化，巨噬細胞內只見形狀類似雞紅細胞大小的空泡，邊緣正齊，胞核隱約可見。二 中性粒細胞吞噬作用的測定（小吞噬） ：基本原理血液中的中性粒細胞有吞噬病原微生物等較小異物的能力。將新鮮血液和細菌混合，經合適的時間后涂片染色，即能觀察到被吞噬到中性粒細胞內的但還沒有被消化掉的細菌。實驗材料 白色葡萄球菌：肉湯培養液中 37 C°培養16-18小時待用。 新鮮抗凝人血 0.5ml。 瑞氏染液、顯微鏡、孵箱、玻片等。實驗方法1吸取0.1

9、ml白色葡萄球菌液加入新鮮抗凝人血0.5ml中，搖勻，37 C°孵育30分鐘。2孵育過程的前 20分鐘，每隔5分鐘輕輕振蕩一次，共4次，后10分鐘靜置孵育。 孵育結束后，用毛細滴管從紅細胞層表面吸取上清少許推片。 自然干燥后，滴加瑞氏染液染色 1分鐘，再加等量蒸餾水混勻，靜置4分鐘水洗，晾干油鏡觀察。實驗結果計算 100個中性粒細胞，分別計算吞噬有細菌的中性粒細胞數目和被吞噬的細菌總數，計算吞噬百分比和吞噬指數，正常人吞噬百分比為60%，吞噬指數大于1。（計算方法同前）注意事項 血涂片應薄厚均勻適中，避免過薄或過厚。 瑞氏染液染色時間不能過長以免染色過重。（謝 明）實驗三 溶菌酶的溶

10、菌作用實驗目的證實體液中溶菌酶的存在及溶菌酶對革蘭氏陽性菌的溶解作用。基本原理溶菌酶的殺菌機理是其作用于細菌細胞壁的粘肽層，粘肽是細菌的細胞壁主要成分。溶菌酶能切斷粘肽結構中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的- 1,4糖苷鍵，破壞粘肽支架，使細胞壁破壞。由于細菌細胞壁的重要功能之一是保護細菌，即抗低滲，故細菌失去細胞壁的保護作用后，在低滲環境中可發生溶解。溶菌酶的主要作用對象是革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性細菌細胞壁粘肽層外還有脂多糖、外膜和脂蛋白結構，故在一般情況下溶菌酶不易發揮直接做用。實驗材料 溶壁微球菌（ M.Lysodeikticus）：本菌是由空氣中分離出的一種革蘭氏陽性菌，對人不

11、致病，菌落黃色，普通瓊脂培養基生長良好，每月傳代一次或凍干保存，用于制備溶壁微球菌瓊脂平板。 標準溶菌酶：稱取溶菌酶標準純品，用 1/15mol.L -1 PBS配制為1000ug/ml原液，并稀釋為100、50、10 ug/ml標準液，用前保存在冰箱中；用于陽性對照及制備標準曲線。 唾液：用無菌平皿收集唾液，可在同學間收集。 其它：無菌打孔器（孔徑 2mm），無菌毛細吸管、米尺等。實驗方法 用無菌打孔器在溶壁微球菌瓊脂平板上打孔，用針頭挑出孔內瓊脂，孔徑 2mm左右，孔距5-20mm。 用毛細吸管取新鮮收集的唾液加入瓊脂孔內，每孔加一滴，每滴約有 0.025ml,同時加標準溶菌酶作陽性對照。

12、 置 24-28 C°下12-18h觀察結果。實驗結果用小米尺或三角板量取小孔周圍溶菌環直徑，并作記錄，可與標準溶菌酶陽性對照作對比觀察。如需定量測定檢品（唾液）中的溶菌酶含量，可將上述各種稀釋度的溶菌酶標準溶液，分別加入小孔中，同法測定溶菌環直徑，用半對數紙制成標準曲線，檢品中的溶菌酶含量可從標準曲線上查出。附錄 溶壁微球菌瓊脂平板的制作：溶壁微球菌在使用前于瓊脂斜面上傳代一次，然后接種于普通瓊脂平板 ,37C°培養24小時，用1/15mol.L -1 PBS或無菌蒸餾水洗下菌苔，洗滌兩次，2000r/min，離心30min，棄上清，稱量沉淀物濕重, 用無菌蒸餾水配成10

13、0mg/ml的菌液。稱取優質瓊脂粉1g加入1/15mol.L -1 PBS 100ml,制成1%瓊脂。取上述菌液1ml, 加入加熱融化并放至50-60 C°的瓊脂中，搖勻傾注平板。冷凝后即為溶壁微球菌瓊脂平板。 1/15mol.L -1 PBS的制備：1/15mol.L -1 KH2PO4: KH2PO4 9.07g加蒸餾水至1000 ml；1/15mol.L -1 Na2HPO4: 1/15mol.L -1 Na2HPO411.87g加蒸餾水至1000 ml；1/15mol.L -1 PBS(pH6.4)：取1/15mol.L -1 KH2PO4 73ml加1/15mol.L -1

14、 Na2HPO427ml,加NaCL0.5g即為pH6.4的1/15mol.L -1 PBS。（謝 明）實驗四 血清總補體活性測定（CH50單位測定）實驗原理補體能使抗體致民敏的羊紅細胞發生溶血反應,根據溶血程度可測定補體總活性。以溶血百分率作縱坐標,相應的血清補體量為橫坐標繪圖,可知在50%溶血附近補體的量與溶血的程度呈直線關系。因此以50%溶血作為終點較以100%溶血作為終點更為敏感。故稱為50%溶血試驗,即CH50（50%complement hemolysis）。產生50%溶血所需補體的量為一個CH50單位。實驗材料待測患者血清5%綿羊紅細胞懸液3/0.1ml溶血素PH7.2巴比妥緩沖

15、液或生理鹽水370C水浴箱、小試管、吸管等實驗方法取小試管8支,依次編號；1-6管加入巴比妥緩沖液0.2ml；于第1管加入待測血清0.2ml,混勻后吸出0.2ml加入第2管 依次對倍稀釋至第6管,從第6管吸取0.2ml棄去,此時各管血清稀釋度依次為1/2、1/4 、 1/81/64 ；1-6 管加入巴比妥緩沖液 0.2ml,第7管加0.4ml,第8管加0.5ml ，1-7加溶血素0.1ml ；每管各加綿羊紅細胞 0.1ml,輕輕搖勻,置370 C水浴箱30分鐘,40C 冰箱過夜。血清總補體活性測定操作表 單位： ml6為實驗測定管；第7管為溶血素對照管；第8管為綿羊紅細胞對照管50% 標準溶血

16、管的配置：取5%綿羊紅細胞1ml,離心后棄上清,加入蒸餾水0.5ml,使紅細胞全部溶解,再加雙倍（1.7%）生理鹽水0.5ml,混勻后加5%綿羊紅細胞1ml。混勻取此液 0.1ml加巴比妥緩沖液0.5ml即為50%標準溶血管。實驗結果以50%溶血管為標準,肉眼依次觀察,與標準管最接近者為終點管。按下式計算1ml血清的補體單位。血清中補體活性單位（CH 50 單位） = 1/血清總量×終點管稀釋倍數本法測得血清總補體活性的正常值為80-160CH50/ml注意事項待測血清要求新鮮，一般要求在去血后 2小時做完實驗。試管口徑大小一致，清潔透明，便于觀察。50%標準溶血管配置必須用同批實驗

17、用綿羊紅細胞，并同時方入冰箱。思考題：何謂一個 CH50單位？何謂溶血素？如何計算每 ml血清所含的CH50單位數？（劉如意）第二篇 特異性體液免疫檢測實驗五 凝 集 反 應凝集反應是指細菌、紅細胞等顆粒性抗原或表面覆蓋抗原的顆粒狀物質與相應抗體特異結合，在適量電解質存在的條件下，形成肉眼可見的凝集現象。一、直接凝集反應顆粒性抗原（如細菌、紅細胞等）直接與相應特異性抗體結合，在適量電解質存在條件下，出現肉眼可見的凝集現象，稱直接凝集反應。參加凝集反應的抗原稱為凝集原，而抗體則稱為凝集素。直接凝集反應有玻片法和試管法兩類。（一）玻片凝集反應在玻片上進行的直接凝集反應,主要用于抗原的定性分析,數分

18、鐘之內便可觀察結果,快速、簡便。常用于細菌的分型鑒定,也用于ABO血型的測定。【 實驗材料】（ 1）抗原：受檢菌液或受檢者的血細胞鹽水懸液。（ 2）抗體：用于細菌鑒定的1：20稀釋診斷血清。血型檢測的A及B診斷血清。（ 3）生理鹽水、玻片、吸管、接種環。【 實驗方法】（ 1）于潔凈玻片的一端加診斷血清1滴，另一端加生理鹽水1滴作陰性對照。（ 2）用接種環取待檢菌液或血細胞懸液分別涂于診斷血清和生理鹽水，混勻。（ 3）輕搖玻片，靜置數分鐘，觀察結果。【 結果分析】玻片上抗原凝集成肉眼可見的小團塊狀或絮狀凝集物，其周圍液體澄清，為陽性反應。陰性反應和生理鹽水對照均不發生凝集，為均勻混濁的乳狀液。【

19、 注意事項】細菌鑒定時，特別是腸道菌種的沙門菌屬或志賀菌屬，原則上先用多價診斷血清檢測，如為陽性，再用單價診斷血清進行分群或定型。血型測定時，室溫需保持在 20oC左右，若低于10oC，易出現冷凝集現象而造成假陽性的錯誤診斷。（二）試管凝集反應是用定量的顆粒性抗原懸液與一系列倍比稀釋的待檢血清在試管中進行的凝集反應，根據試驗結果判定待檢血清中有無相應抗體及其效價，對血清中抗體進行半定量分析。此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫學診斷，例如，診斷傷寒和副傷寒的肥達氏（ Widal test）反應，診斷斑疹傷寒的外裴氏反應（weil-felix test）。【 實驗材料】診斷菌液, 1:10稀

20、釋的待檢血清，生理鹽水，小試管，刻度吸管，試管架，恒溫水浴箱。【 實驗方法】（1）稀釋待檢血清取8支試管排列于試管架上,依次編號,每管加入0.5ml生理鹽水。于第1管中加入0.5ml待檢血清,充分混勻后,吸出0.5ml加入第2管,同法混勻后又吸出0.5ml加入第3管,依次類推,連續稀釋至第7管,最后從第7管中吸出0.5ml棄去。第8管為生理鹽水對照管。（2）于各管中加入診斷菌液0.5ml,振搖試管架，充分混勻。試管凝集反應操作程序(3)將試管靜置于37oC恒溫水浴箱中40min。【 結果分析】（ 1）首先觀察陰性對照管，應無凝集現象，管底沉積呈圓形，邊緣整齊，輕輕搖動則沉積菌分散均勻呈混濁現象

21、。 觀察實驗管，凝集現象可根據強弱程度，分為五級：+ 細菌全部凝集，管底形成大片凝集物。+ 細菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。+ 約半數的細菌發生凝集，管底出現凝集環。+ 僅有少部分細菌凝集，管底可見沉積的細菌周邊有稀疏、點狀的凝集物。 液體混濁，無凝集。（ 3）血清抗體效價的判定：以出現明顯凝集現象（+）的血清最高稀釋度作為受檢血清的抗體效價。【 注意事項】實驗中應注意反應體系的溫度、電解質濃度及酸堿度（ pH值）。二、間接凝集反應將可溶性抗原（或抗體）先吸附在一種與免疫無關，一定大小的載體顆粒表面成為致敏載體顆粒，然后與相應抗體（或抗原）結合，在適量電解質存在的條件下，出現肉眼可見

22、的特異性凝集現象，稱間接凝集反應，此法敏感度比直接凝集反應高，因而廣泛地應用于臨床檢測中，間接凝集反應中常用的載體顆粒有人 “ O”型紅細胞、動物紅細胞、活性炭或硅酸鋁顆粒，聚苯乙烯乳膠微球等。（一）正向間接血凝試驗將綿羊紅細胞或人的“ O”型紅細胞用醛類固定（稱為醛化，可改變血球表面性質，使其易于吸附蛋白質類抗原，并可長期保存使用），再將可溶性抗原吸附于醛化的血細胞上，制成抗原致敏的紅細胞，當與相應的抗體結合，使紅細胞被動的聚合在一起，出現肉眼可見的凝集現象，常用于檢測傳染病抗體或自身抗體。【 實驗材料】（ 1）抗原制備：將傷寒桿菌接種在培養基上，37oC培養24小時，用生理鹽水洗下，100

23、oC水浴2小時，離心棄上清，稀釋后備用。（ 2）致敏紅細胞的制備：取稀釋的抗原與等體積的已醛化的2%SRBC混合，37oC水浴2小時，每隔15分鐘振搖一次，取出后洗滌棄上清，稀釋成0.5%備用。（ 3）試管、試管架、刻度吸管、恒溫水浴箱。【 實驗方法】（ 1）取8支小試管排列于試管架上，依次編號。每管加入0.25ml生理鹽水。于第1管內加入1:10稀釋的免疫血清0.25ml混勻，倍比稀釋至第7管。第8管為陰性對照。（ 2）每管中加入0.25ml致敏綿羊紅細胞，振搖試管架，使之充分混勻。（ 3）將試管架靜置于37oC恒溫水浴箱中1小時。正向間接血凝試驗操作程序【 結果分析】（ 1）首先觀察陰性對

24、照管，應無凝集現象，管底紅細胞沉積呈圓形，邊緣整齊，輕輕搖動則沉積菌分散均勻呈混濁現象。（ 2）觀察實驗管，凝集現象可根據強弱程度，分為五級：+ 細菌全部凝集，管底形成大片凝集物。+ 細菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。+ 約半數的細菌發生凝集，管底出現凝集環。+ 僅有少部分細菌凝集，管底可見沉積的細菌周邊有稀疏、點狀的凝集物。 液體混濁，無凝集。（ 3）血清抗體效價的判定：以出現明顯凝集現象（+）的血清最高稀釋度作為受檢血清的抗體效價。【 注意事項】 紅細胞需來自同一個體、批號相同，且致敏血球應新鮮配置。 使用器材必須清潔，否則對結果有很大影響。（二）反向間接血凝試驗將特異性抗體吸附于

25、醛化的紅細胞上，再與相應抗原結合，在適量電解質存在條件下，紅細胞被動聚集出現肉眼可見凝集現象。用于檢測標本中的相應可溶性抗原。【 實驗材料】（ 1）1:20抗HBs致敏的醛化血球、純化的1:20抗HBs、待檢血清、稀釋液。（ 2）“V”型微量血凝板，0.025ml稀釋棒、微量攪拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）。【 實驗方法】（ 1）配制致敏血球懸液 于每瓶凍干診斷血球加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻血球懸液，濃度約為0.6%。（ 2）正式試驗 在“V”型微量血凝板上，每份待檢血清設立8孔，于各孔內用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（相當于0.025ml）。 用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待

26、檢查血清分別依次在各孔內捻轉作倍比稀釋（一般每孔內均需捻轉10次左右），直至第7孔，第8孔為致敏血球對照。另設第9孔為陽性對照，加0.025mlHBsAg陽性血清。 于每孔中加0.025ml混勻的致敏血球懸液。 將血凝板置于微型振蕩器上振蕩12分鐘，置37oC1小時后觀察結果。反向間接血凝試驗操作程序【 結果分析】不凝集：紅細胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點。明顯凝集（+）：紅細胞于孔底形成薄膜狀凝集，中央可見疏松的紅點。出現明顯凝集的血清最高稀釋度為 HBsAg效價，凡效價1:16者需進一步做中和試驗。中和試驗在血凝板上每份標本設測定排與對照排，每排 8孔。于每孔加稀釋液0.025ml

27、，用2支稀釋棒蘸取被檢血清，分別在2排作倍比稀釋到第7孔，第8孔不含血清，為血球對照，然后，于測定排各孔加稀釋液0.025ml，對照排各孔加1:20抗HBsAg0.025ml，血凝板振蕩12分鐘，置37oC30分鐘。取出，于各孔加0.025ml致敏血球，振搖混勻，置37oC1小時后觀察結果。凡正式試驗效價 1:16，且中和試驗的對照排凝集孔數至少低于測定排凝集孔數2孔者，為HBsAg陽性，否則系非特異性凝集。【 注意事項】（ 1）配制的致敏血球懸液一般當天用完，若置210oC，使用期不超過3天。（ 2）試驗用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。 血凝板、稀釋棒用后

28、均需用次氯酸鈉（ 10%v/v）浸泡過夜；滴管需煮沸10分鐘，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。思考題： 試述直接凝集反應和間接凝集反應的異同點。 正向間接血凝試驗與反向間接血凝試驗在原理上有何相同和不同？正向間接血凝試驗可否應用微量血凝板測定法？（雷艷君）實驗六 沉淀反應可溶性抗原（如血清中的蛋白,組織浸出液,細胞裂解液等）與其相應的抗體在溶液中或凝膠中結合,若比例合適,可形成肉眼可見的抗原-抗體復合物,這就是免疫沉淀反應。免疫沉淀反應可以在小玻璃管中或毛細玻璃管及凝膠平板中進行。在用凝膠平板做實驗時,常用瓊脂糖凝膠做介質,有的加電流,使反應更快更靈敏。一、環狀沉淀【 實驗原理】在環狀

29、沉淀試管中，當可溶性抗原與相應特異性抗體結合后，于兩者交界面處可形成白色沉淀環。此法系Ascoli于1902年建立，用于檢查獸類內臟、皮毛浸液等標本中炭疽桿菌抗原，由于其較高的靈敏性和特異性，目前仍用于法醫學血跡鑒定、流行病學媒介昆蟲的吸血習性鑒定等。【 實驗材料】待測血跡干燥紙片抗人血清抗體、抗羊血清抗體和抗雞血清抗體生理鹽水環狀沉淀管及管架、吸管等。【 實驗方法】1、取環狀沉淀管3支，分別加入抗人、抗羊和抗雞血清抗體各0.1ml 于管底部，并注明，置于管架上。2、另取3支試管，分別將3種血跡紙片加入，再各加生理鹽水1ml，室溫5-10分鐘后將溶液搖勻。3、吸取上清液分別加入上述含有抗人、抗

30、羊、抗雞血清抗體的環狀沉淀管內，并使兩者形成一清晰交界面。置室溫下1-5分鐘觀察結果。【 結果分析】根據是否與已知抗血清出現白色沉淀環，判定血跡類型。【 注意事項】1、因血清分子密度及比重均大于生理鹽水，故當加入含有抗原的生理鹽水時只需將沉淀管傾斜，加抗原的吸管勿接觸抗血清，使含抗原的生理鹽水沿管壁緩緩流下，再將沉淀管直立即可呈一清晰交界面。2、在加抗原時，吸管的頭部切勿觸及抗血清，否則不僅使抗原抗體混合，不能呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，必然會出現交叉反應，無法判定結果。二 單向擴散【 實驗原理】抗原或抗體這兩種成分中只有一種擴散，將已知抗體與瓊脂混合，

31、將抗原置于凝膠孔中，抗原則呈輻射狀擴散，在孔的周圍與抗體結合，在比例合適的地方形成肉眼可見的沉淀環。當抗體的濃度一定時，抗原的濃度與形成沉淀環的直徑成正比。【 實驗材料】1% 瓊脂糖（瓊脂糖1g,0.1mol/L pH 8.6 巴比妥-巴比妥鈉緩沖液100ml），玻片或培養皿，凝膠打孔器（直徑3mm），水浴箱， 10ml 吸管， 5l微量加樣器，已知抗體，標準抗原，待測抗原。【 實驗方法】1 ） 取一張玻璃片，用水沖洗干凈，再用少量 75% 乙醇沖洗，晾干后置于水平臺備用。2 ）將 1% 瓊脂糖融化， 56 水浴中保溫3 ） 取 15ml 瓊脂糖加到 56 預熱的玻璃管中，加入適量的抗體（約

32、200ml ）充分混勻后平鋪于玻璃片上。4 ） 待凝膠凝固后打孔（直徑3mm）5 ） 將系列稀釋的標準抗原和待檢抗原分別加到凝膠孔中，每孔 5 l6 ） 將凝膠板置于濕盒，室溫過夜（24h 以上）后觀察結果。、7 ）繪制標準曲線，測出樣品中相應抗原含量。 結果分析 1 本實驗主要用于檢查血型中 IgG ， IgA ， IgM 以及補體成分 C3 ， C4 等的含量 / 由于各類免疫球蛋白的分子量大小不等，因此同樣濃度的 IgG ， IgA ， IgM 在瓊脂糖中的擴散速度各異， IgG 擴散最快，形成的沉淀環直徑最大， IgM 的分子量最大，擴散速度慢，形成的沉淀環較小。2 形成的沉淀環大小與

33、抗原或抗體的濃度相關，因此臨床檢測時應先調整抗體和抗原各自的最適濃度，抗體的最適濃度應使免疫擴散后的沉淀環邊緣清晰，且能測出血清中的免疫球蛋白的正常值和最大限度的異常值。抗體濃度過高，形成的沉淀環直徑小；濃度過低，不易檢測抗原的最高限濃度。沉淀環的大小與所檢測的抗原濃度成正比。抗原濃度過低時，沉淀環太小不易測定，過高時，沉淀環太大，浪費抗體。單向擴散示意圖 三 雙向擴散【 實驗原理】雙向免疫擴散是指抗原和抗體在同一凝膠內部擴散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。該反應是將抗原和抗體加入同一凝膠中兩個相隔一定間距的小孔內，使兩者進行相互擴散。當抗原和抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧型沉淀線

34、。【 實驗材料】1% 瓊脂糖，玻片或培養皿，凝膠打孔器（直徑 3mm ），水浴箱， 10ml吸管， 5 l 微量加樣器，抗原，抗體。【 實驗方法】1 ）取一張玻璃片，用水沖洗干凈，再用少量 75% 乙醇沖洗，晾干后置于水平臺備用。2 ）將 1% 瓊脂糖融化， 56 水浴中保溫。3 ）將 1% 凝膠約 3ml 鋪于玻片上，待凝固后打孔，直徑 3mm ，間距 10mm 。（如圖所示）4 ）中心孔加 5 l 抗體，周圍孔內每孔加 5 l 抗原樣品（抗原抗體均需預先做系列稀釋以獲得適宜的抗原抗體比例）。5 ）將凝膠板置于濕盒，室溫過夜（ 24h 以上）后觀察結果。【 結果分析】1 ）陽性結果為在抗原孔

35、與抗體孔之間出現沉淀線。若出現幾條沉淀線表明抗原與抗體均不是單一組分。2 ）此法可用來比較兩個抗原的相關性。當兩種抗原的決定簇完全相同時，則與抗體形成的沉淀線相吻合；若兩抗原的決定簇完全不同時，則與抗體形成的沉淀線呈不相關的交叉線；若兩種抗原有部分決定簇相同時，則與抗體形成呈部分交叉的沉淀線。雙向擴散示意圖 四 火箭電泳將抗原抗體反應置于一定的電場中進行，能使抗原抗體反應更加快速，靈敏。根據方法的不同，主要有火箭電泳，對流免疫電泳，交叉免疫電泳等。【 實驗原理】火箭電泳是把單向擴散技術與電泳技術結合起來。抗原在含有抗體的瓊脂糖凝膠中電泳時，在電場的作用下，抗原向一個方向移動并逐步與凝膠中的相應

36、抗體結合形成沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比。【 實驗材料】1% 瓊脂糖，玻片或培養皿，凝膠打孔器（直徑 3mm ），水浴箱， 10ml吸管， 5 l 微量加樣器，已知抗體，標準抗原，待測抗原，電泳儀。【 實驗方法】1 ）取一張玻璃片，用水沖洗干凈，再用少量 75% 乙醇沖洗，晾干后置于水平臺備用。2 ）將 1% 瓊脂糖融化， 56 水浴中保溫3 ）取 15ml 瓊脂糖加到 56 預熱的玻璃管中，加入適量的抗體（約 200ml ）充分混勻后平鋪于玻璃片上。4 ）待凝膠凝固后打孔（直徑 3mm ）5 ）將系列稀釋的標準抗原和待檢抗原分別加到凝膠孔中，每孔 5 l6 ）在 35v/cm 電場

37、中電泳 30min 。7 ）根據標準稀釋抗原的峰高繪制標準曲線，計算待檢樣品的抗原含量。【 結果分析】1 ）本實驗主要用于抗原的測定（只能測定 g/ml 以上的含量）。計算方法同單向擴散，均需先根據系列稀釋的標準抗原的峰高作出標準曲線，然后在標準曲線上找出待檢抗原對應的濃度。2 ）可用于檢測血清免疫球蛋白或分泌型 IgA 及補體 C3 等的含量。3 ）一般來說，抗原應放在負極的一側，因為多數蛋白性抗原在堿性電泳緩沖液中帶負電，在電場中向陽極運動。五 對流免疫電泳【 實驗原理】當抗原和抗體在瓊脂介質中電泳時 ，抗體的 PI 比較高，在適當的 pH 值下，抗體帶正電荷而抗原帶負電荷，故在電場中抗體

38、向陰極方向移動而抗原向陽極運動，直至相遇后形成沉淀線，其原理與雙向免疫擴散相同，但具有方法簡便，快速及一次電泳可以檢測多個樣品等特點。【 實驗材料】1% 瓊脂糖，玻片或培養皿，凝膠打孔器（直徑 3mm）,水浴箱， 5l 微量加樣器，抗體，抗原，電泳儀，陽性對照血清，濾紙【 實驗方法】1 ）取一張玻璃片，用水沖洗干凈后，再用少量 75% 乙醇沖洗，晾干后置于水平臺備用。2 ） 1% 瓊脂糖融化， 56 水浴中保溫3 ）吸取瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚約 1.5mm ），制成所需膠板。4 ）等待瓊脂糖凝固后，用打孔器成對打孔，孔徑 3mm ，孔間距 3mm 。排距 3mm 。5 ）在孔中分別加入抗原和抗

39、體，每孔 5 l6 ）在電場中電泳 30 分鐘（ 5v/cm ）7 ）觀察結果。在兩孔間出現沉淀線的為陽性。【 結果分析】本實驗是定性實驗，用于多種疾病的檢測，如 HbsAg ， AFP 等的檢測，血吸蟲，包蟲病等抗體的測定。 五 免疫電泳 原理 在凝膠介質中將區帶電泳法與免疫雙擴散相結合的一種免疫化學方法。先使血清在瓊脂糖凝膠中電泳，在一定的電場強度下，由于血清中各種蛋白質的分子大小及電荷狀態和電荷量不同，泳動速率也各不相同，使各自組分得到分離，然后在電泳軸的平行方向挖一長槽，加入抗血清，抗原與相應抗體擴散，相遇，出現沉淀弧線。 材料 1% 瓊脂糖，玻片或培養皿，凝膠打孔器（直徑 3mm ）

40、，水浴箱， 5 l 微量加樣器，抗體，抗原，電泳儀，陽性對照血清，濾紙 方法 1 ）將玻璃板洗干凈，用 75% 乙醇沖洗，晾干備用2 ）將 1% 瓊脂糖融化， 56 水浴中保溫備用3 ）鋪板，打孔。4 ）將凝膠孔加滿抗原，其中一孔加電泳指示劑。5 ）將凝膠板放在電泳槽中進行電泳 10v/cm ，根據指示劑判定電泳時間。6 ）電泳后在凝膠板上沿電泳方向平行挖 2mm 左右寬的長槽，其中加入抗血清或特異性抗體。7 ）將凝膠板轉入濕盒中，室溫放置 12 或 18 小時，可觀察到在一定位置出現的沉淀弧線。 結果與分析 臨床上常用于 M 蛋白血癥，確認該異常蛋白屬于哪一亞類免疫球蛋白，或哪一型輕鏈。 鑒

41、定蛋白質抗體，為單價抗體或多價抗體，如檢測多克隆丙種球蛋白血癥中同時存在的高含量 IgG ， IgA 和 IgM 。 鑒定未知蛋白抗原（或抗體）。免疫電泳示意圖思考題1 免疫沉淀實驗中哪些可以用來檢測抗原，哪些用來檢測抗體？哪些是定性的，哪些可以定量。2 免疫沉淀反應與凝集反應在應用方面有什么區別？實驗七 補體結合反應 原理 抗原與抗體結合形成的復合物能激活補體，若抗原是綿羊紅細胞，那么補體被激活后，使綿羊紅細胞溶解，出現溶血現象。補體結合實驗是一種有補體參與，并以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統的抗原抗體反應。參與本反應的五種成分可分為兩個系統，一為待檢系統，即為已知抗原（或抗體）和待檢抗體（

42、或抗原）另一個為指示系統，即綿羊紅細胞和其相應的溶血素。待檢抗原，抗體和先加入的補體作用后，再加入指示系統。若待檢系統中的抗原 - 抗體相對應，兩者特異性結合后激活補體，再加入的指示系統無補體結合，不出現溶血，是為補體結合實驗陽性；若待檢系統中的抗原與抗體不對應或缺少一方，補體不被激活，當指示系統加入后，綿羊紅細胞 - 溶血素復合物激活補體，產生溶血現象，是為補體結合實驗陰性。本實驗敏感性，特異性均較高，可用于檢測某些病毒病，立克次體病，梅毒病等。由于參與反應的各成分之間要求有適當的量的關系，因此，做本實驗之前必須通過一系列預備實驗來確定補體，溶血素，抗原或抗體的使用量。 方法 一）溶血素單位

43、滴定1 材料：溶血素血清，抗原， 2% 綿羊紅細胞懸液，補體（1:30 取豚鼠新鮮血清），生理鹽水，小試管，吸管,37 水浴箱。2 實驗過程1 ）按表分別加入各種不同稀釋的溶血素 0.2ml 及其他成分。2 ）充分混勻后置于 37 水浴箱中 30 分鐘，然后觀察結果。3 ）能呈現完全溶血的最高稀釋度的溶血素為 1 個單位4 ）配制 2 個單位的溶血素溶液。例如下表的結果表明，第11管（1:9600 倍稀釋）中0.2ml溶血素為1個單位。實驗室常用0.2ml中含2個溶血單位的稀釋液，即1:4800,配制時可以取 1:100 倍稀釋的溶血素1ml 加生理鹽水47ml 。例：溶血素的滴定表 :試管號

44、溶血素 0.2ml稀釋度補體(1:30)生理鹽水2% 綿羊紅細胞結果11 ： 10000.20.40.237 致敏血球水浴 30 分鐘完全溶血21 ： 12000.20.40.2完全溶血31 ： 16000.20.40.2完全溶血41 ： 20000.20.40.2完全溶血51 ： 24000.20.40.2完全溶血61 ： 32000.20.40.2完全溶血71 ： 40000.20.40.2完全溶血81 ： 48000.20.40.2完全溶血91 ： 64000.20.40.2完全溶血101 ： 80000.20.40.2完全溶血111 ： 96000.20.40.2完全溶血121 ： 1

45、28000.20.40.2完全溶血131 ： 160000.20.40.2完全溶血對照0.20.40.2完全溶血二）補體單位滴定1 材料1）補體 1:30 稀釋。2）抗體2單位溶血素3）抗原2%綿羊紅細胞4）生理鹽水,小試管，吸管,37水浴箱2方法1）依下表加入1:30 稀釋的補體。2）依次加入其他各成分至每管中,37水浴后觀察結果3）補體單位的確定 凡能使一定量紅細胞發生完全溶解的最小補體量，稱為1個確定單位。如下表中自第3管可出現完全溶血現象，因此第3管 0.1ml）所含補體為1個確定單位。由于在實際應用時補體有一部分損失，故需酌量增加一些，通常取其次高的一管補體量稱為1個使用單位。在下例

46、中：1 個確定單位 =0.1ml 1:30 稀釋的補體。1 個使用單位 =0.12ml1:30 稀釋的補體。4 ）補體的稀釋 若使每 0.2ml 補體含 2 個使用單位，可照下式計算： 30 :（2 × 0.12 ） = x : 0.2X= =25試管號補體（ 1 ： 30 ）生理鹽水37 水浴45分鐘溶血素(2 單位 )2% 羊紅細胞懸液37 水浴1530分鐘結 果10.060.540.20.2不溶血20.080.520.20.2不溶血30.100.500.20.2不溶血40.120.480.20.2不溶血50.140.460.20.2不溶血60.160.420.20.2不溶血70

47、.180.400.20.2不溶血80.600.20.2不溶血即將補體稀釋25倍，取0.2ml即可。三）正式實驗正式實驗可以做定量的，也可以做定性的。本實驗用傷寒桿菌的提取液為抗原，與其免疫血清做定性實驗。1 材料1）補體 1:25 稀釋2）抗體 1:5 稀釋的傷寒血清3）抗原 1:50 稀釋的傷寒抗原,1:50 稀釋的痢疾抗原4）指示系統2單位溶血素,2% 綿羊紅細胞。5 ）其他 同預備實驗2 方法按下表順序操作:試管號傷寒血清傷寒抗原痢疾抗原補體生理鹽水37 水浴 45 分鐘溶血系統混勻后3水浴 30分鐘結果10.20.20.2實驗管20.20.20.2特異性對照30.20.20.2血清對照

48、40.20.20.2抗原對照50.20.4補體對照60.6溶血素對照3結果觀察各管溶血情況，記錄并分析其意義。4注意事項1 ）以細菌做抗原時，應使用細菌的提取液而不是懸液，通過滴定找出最合適的稀釋度2 ）所用試管，微量板，吸管等器材必須清潔無脂，各試劑無菌，以防止抗補體現象。3 ）除了免疫球蛋白外，本實驗中的其他成分均需要滴定。思考題1 本實驗中設立的對照有什么意義，如果去掉是否可以？實驗八 中和實驗（ Neutrlization test ）中和實驗是一種特異性和敏感性均很高的血清學實驗。在體外，病毒可以被相應的特異性抗體中和而失去其感染性，通過單層細胞培養檢驗病毒的感染性是否失去的方法稱為

49、中和實驗。中和實驗是以測定病毒的感染性為基礎，所以該實驗必須在動物，雞胚或組織培養細胞等活性體內進行，必須選用對病毒敏感的細胞，動物或雞胚為材料，根據實驗的不同目的設置嚴格的對照實驗。中和實驗的主要應用是：1 鑒定病毒：中和實驗具有很高的特異性，利用已知型別的免疫血清與未知病毒做中和實驗，如被中和，不但可以定量，而且可以定性。2 可以用于分析病毒的抗原性。3 測定免疫血清的效價和疫苗免疫后的抗體反應。4 測定血清中的抗體滴度，用于診斷病毒性疾病。原理特異性的抗病毒免疫血清中和抗體與病毒作用，能夠抑制病毒對敏感細胞的吸附、穿入和脫殼，從而抑制了病毒的增殖，使 病毒失去感染性，中和實驗常用有兩種方

50、法：一種是用已知病毒檢測被測血清中的抗體效價，另一種是用已知免疫血清鑒定病毒型別。一 ）中和實驗方法一用已知病毒檢測被檢血清中的抗體效價1 材料1 ）病毒懸液：選用、型脊髓灰質炎病毒液各 1.5ml 。使用前用 Eagle 維持液稀釋至 100TCID50/0.1ml 含量（ TCID50 即能使 50% 組織培養管發生細胞病變的病毒量）2 ）待檢血清；用前 56 30 分鐘滅活，以除去非特異性抑制物3 ）敏感細胞：需長成單層，一般需 2-4 天，根據細胞種類和繁殖程度確定，本實驗選用 Hela 細胞培養管 40 只。4 ）滅菌 Eagle 維持液、滅菌小試管 15 只、滅菌 1ml 吸管，

51、37 水浴箱， 37 5%CO 2 培養箱和顯微鏡。2 方法a 實驗組實驗方法（ 1-5 號管）1) 稀釋血清：取 15 支滅菌試管，分成三排，每排 5 只分別編號。將待檢血清用 Eagle 維持液從 1 ： 5 按四倍遞增稀釋到 1:1280, 稀釋后的血清每管 0.25Ml.2) 在第一排各試管內，每管加入型病毒液 0.25ml ，第二排各試管內，每管加入型病毒液 0.25ml ，第三排各試管內，每管加入型病毒液 0.25ml ，加完后搖動試管架充分混勻，置 37 水浴箱 1 小時取出。3) 取 30 只 Hela 細胞培養管，棄去培養液，在每支培養管中加入上述病毒與血液混合液 .0.2m

52、l ，每份混合液接種 2 支細胞培養管。接種后，培養管置于 37 水浴 1 小時取出，于每支培養管內加入 0.8mlEagle 維持液，送 37 5%CO 2 培養箱培養。b 實驗對照組實驗方法1 ）病毒對照組（6號管）取 6 只 Hela 細胞培養管，棄去培養液，每支試管中加病毒液 0.1ml ，每型病毒液各接種 2 只培養管。然后送 37 水浴保溫 1 小時取出，于每支培養管中加入 0.9mlEagle 維持液，送 37 5%CO 2 培養箱 培養。2 ）血清對照組（ 7 號管）取 2 只 Hela 細胞培養管，棄去培養液，每支試管中加 1:20 稀釋的待檢血清 0.1ml ，然后送 37

53、 水浴保溫 1 小時取出，于每支培養管中加入 0.9mlEagle 維持液，送 37 5%CO 2 培養箱培養。3 ）細胞對照管（ 8 號管）取 2 只 Hela 細胞培養管，棄去培養液，送 37 5%CO 2 培養箱培養。3 結果在培養第 3 ， 5 ， 7 天各觀察一次，觀察時將細胞培養管從溫箱取出，顯微鏡低倍視野下觀察有無 CPE （細胞病變效應），并按表記錄。當細胞出現 CPE 時，可見磁暴生長減緩或停止生長，細胞變大，腫脹，甚至死亡，脫落。觀察后，出現 CPE 的培養管可棄去，未出現 CPE 的培養管繼續送 37 5%CO 2 培養箱培養至第 7 天。中和實驗 CPE 結果記錄:結果判定1 病毒對照組均應出現 CPE 為“”2 血清對照組和細胞對照組不應出現 CPE ，為“”。二） 中和方法實驗二用已知免疫血清鑒定病毒型別1 材料1 ） 病毒懸液：選用未知型別的脊髓灰質炎病毒 1 ： 10 稀釋液 1ml 。2 ）免疫血清：選用、型脊髓灰質炎病毒免疫血清（ 1 ： 5 稀釋）各 0.35ml 。3 ）敏感細胞：選用 Hela 細胞培養管 15 支。4 ）其余材料同方法一。2 方法a 實驗組實驗方法1 ） 取待鑒定病毒稀釋液 0.75ml 分別與三型特異性免疫血清（各 0.25ml ）等量混合，在 37 水浴 1 小時取出。2 ）取 6 支 Hela 細胞培養管，棄去培