1、HER2/neu原癌基因胞外區(qū)片段DNA克隆及其在小鼠中誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答摘要目的：研究 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)片段（ECD） DNA 直接肌肉注射 在小鼠體內(nèi)表達(dá)，體液免疫狀況，利用小鼠流產(chǎn)模型觀察其體內(nèi)效應(yīng)。方法： 克隆并構(gòu)建了人及大鼠 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)片段真核表達(dá)載體 pCDNA3-X, 采用肌肉直接注射的方法免疫小鼠，分析目的基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)及其誘導(dǎo) 的免疫應(yīng)答。結(jié)果： 在質(zhì)粒 DNAft接注射部位可檢測到目的基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)了針對(duì) HER2/neu 的抗體反應(yīng)；同時(shí)誘發(fā)小鼠流產(chǎn)，使免疫鼠產(chǎn)仔數(shù)減少， 可觀察到流產(chǎn)結(jié)節(jié)形成。結(jié)論：通過基因免疫，可誘導(dǎo)針對(duì) H

2、ER2/ne u 原癌基因產(chǎn)物的有效免疫應(yīng)答。關(guān)鍵詞 HER2/neu 原癌基因； 胞外區(qū)；DNA 免疫；流產(chǎn)中國書資料分類法分類號(hào)R392.1Induction of Antibody Response by Intramuscular Immunization withHER2/neu Oncogene Extracellular Domain DNA in MiceZhang Yuejian, He Qiuzao, Qin huilian(Departme nt of Immuno logy, Shan ghai Medical Uni versity, Shan ghai 200032

3、)Abstract Objective: To induce an immune response by intramuscular immunizationwith HER2/neu on coge ne extracellular doma in (ECD) DNA and observe the effect invivo by an aborti on model in mice. Methods: Huma n and rat HER2/neu ECD genewere cloned and in serted into expressive vector pCDNA3. The D

4、NA immuni zati on,expressi on of HER2/neu ECD, an tibody detecti on and aborti on in immuni zed micewere studied. Results: HER2/neu ECD protein expressed on muscle cells in theinjected site, specific an tibody to HER2/neu was in duced by DNA immuni zati on. Theaverage of the offspri ng per delivery

5、from immuni zed mice was sig nifica ntly lowertha n that from con trol group, and the abortive embryos were found in uterus fromimmunized mice. Conclusion: The results show that both human and rat HER2/neuECD gene can in duced effective immune resp onse by DNA immuni zati on.Key words HER2/neu on co

6、ge ne extracellular doma in； DNA immuni zati on; abortionHER2/neu 原癌基因位于人 17 號(hào)染色體，編碼 185 kD 的跨膜糖蛋白，具有 酪氨酸蛋白激酶活性，屬表皮細(xì)胞生長因子家族：。它主要在胚胎發(fā)育期間表達(dá)，在成人正常組織極少表達(dá):2：。約 1/3 的乳腺癌和卵巢癌組織中存在 HER2/neu 原癌基因擴(kuò)增和/或過度表達(dá):。曾報(bào)道在部分患者可檢測到針對(duì)HER2/neu 基因產(chǎn)物的抗體和（或）細(xì)胞免疫應(yīng)答，說明機(jī)體可以打破針對(duì) HER2/neu蛋白的自身耐受，使該蛋白可能成為腫瘤治療的靶抗原：4：。我們以前的實(shí)驗(yàn)顯示，利用 HE

7、R2/neu 蛋白免疫小鼠可誘導(dǎo)出較好的特異免 疫應(yīng)答5，但蛋白純化和保存等技術(shù)復(fù)雜且要求較高限制了蛋白質(zhì)免疫的應(yīng) 用。近幾年來DNA 免疫技術(shù)所顯示的優(yōu)點(diǎn)使之迅速發(fā)展，利用質(zhì)粒DNA 直接注射的方法研制新型疫苗，特別是針對(duì)腫瘤抗原的DNA 免疫研究將具有重要意義：6。本研究克隆并構(gòu)建了人和大鼠 HER2/neu 原癌基因 ECD 片段，通過 DNA 直 接肌肉注射免疫小鼠，觀察目的基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)情況，并利用流產(chǎn)模型驗(yàn) 證了HER2/neu ECD因免疫誘導(dǎo)的體內(nèi)免疫效應(yīng)。1材料與方法1.1材料菌株與質(zhì)粒 E. coli DH5a和質(zhì)粒 pCDNA由本室保存。 質(zhì)粒 pSV2neu由 Dr

8、. YujiaoZhang 提供。人 HER2/neu 胞外區(qū) cDNA 由本室克隆。內(nèi)切酶及其他 工具酶分別購自Gibco, San gon 及 NEB 等公司。抗 HER2/neu 蛋白多抗及免疫組 化試劑購自 Dako 公司。 細(xì)胞株 SKBR3 乳腺癌細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)。 質(zhì)粒大量抽 提純化試劑盒購自 Qiagen公司。膠回收及 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自上海華舜生 物工程公司。動(dòng)物：BALB/c 清潔級(jí)小鼠，購自本校動(dòng)物部并飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物 房。1.2方法1.2.1HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)基因克隆大鼠 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)片段采用亞克隆方法，利用Hind 川和 X

9、bal酶切 pSV2-neu,回收并插入 pCDNA 表達(dá)載體。人 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)片 段利用 RT-PCF 方法從人乳腺癌細(xì)胞株 SKBR3S 隆，通過 T-載體轉(zhuǎn)換， NotI/XbaI酶切并插入 pCDNA 表達(dá)載體。兩者均挑選陽性克隆并測序。1.2.2質(zhì)粒大量純化參照 Qiagen 公司操作手冊，生理鹽水溶解，紫外分光法標(biāo)定質(zhì)粒濃度。1.2.3DNA 免疫0.75%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，股四頭肌注射 0.25%丁哌卡因 100 卩 l ; 24 h 后同樣麻醉后，在同一注射部位接種質(zhì)粒 DNA 100 卩 g，2 周后眼眶采血檢測抗 體。1.2.4目的基因在體內(nèi)表達(dá)DNA

10、 免疫小鼠后 48 h， 取注射部位肌肉， 福爾馬林固定， 石蠟包埋切片，以 Dako公司抗 HER2/neu 多抗作免疫組化，觀察目的基因的表達(dá)。1.2.5ELISA 檢測抗體以高表達(dá) HER2/neu 蛋白人乳腺癌細(xì)胞鋪板， 固定后作為抗原， 其余同一般 ELISA法。1.2.6小鼠流產(chǎn)研究DNA 免疫后 2 周，按雌雄 2：1比例交配，以陰栓形成表示交配成功。2224 d 后懷孕小鼠即可產(chǎn)仔。計(jì)數(shù)小鼠產(chǎn)仔率，解剖觀察產(chǎn)鼠子宮流產(chǎn)結(jié)節(jié)。2結(jié)果2.1測序及酶切鑒定獲得含跨膜區(qū)的大鼠 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)和不含跨膜區(qū)人 HER2/neu 胞外區(qū)基因正確序列，1 顯示了 pCDNA3

11、-rEC 和 pCDNA3-hEC 酶切電泳結(jié)果， 說明表達(dá)載體構(gòu)建正確。2.2目的基因在小鼠肌肉表達(dá)2 顯示了人 HER2/neu ECD 免疫后在肌肉表達(dá)的免疫組化結(jié)果，大鼠 HER2/neuECD 基因也顯示同樣的結(jié)果。2.3免疫小鼠產(chǎn)仔數(shù)HER2/neu ECD 基因免疫可影響小鼠妊娠結(jié)局，對(duì)照組平均產(chǎn)仔7.6 0.5只， 大鼠 ECD 基因免疫組平均產(chǎn)仔數(shù)為 2.4 1.9 只， 人 ECD 基因免疫組為 3.2 1.9只，說明人和大鼠 HER2/neuEC 基因免疫均導(dǎo)致小鼠懷孕后產(chǎn)仔數(shù)降 低，提示針對(duì)HER2/neu 原癌基因的免疫應(yīng)答干擾了正常的妊娠過程。1 人和大鼠 HER2

12、/neu 胞外區(qū)基因重組質(zhì)粒酶切電泳譜Fig.1 Electrophoresis an alysis of endonu cleasedigestion of pCDNA3-hECD and pCDNA3-rECD1： Mark; 2: pcDNA3-rECD; 3: pcDNA3-hECD2 HER2/ne u 胞外區(qū)基因直接注射后在小鼠肌肉細(xì)胞的表達(dá)Fig.2 Expressi on of HER2/neu ECD gene on muscle cellsby DNA directed injectio n2.4DNA 免疫誘導(dǎo)抗 HER2/nei 抗體反應(yīng)3 顯示與對(duì)照組相比， ECD

13、基因免疫 2 周后血清產(chǎn)生了抗 HER2/neu 抗體的 結(jié)果。2.5免疫鼠流產(chǎn)結(jié)節(jié)觀察小鼠分娩后解剖觀察，在 HER2/neu ECD 質(zhì)粒免疫組可見明顯流產(chǎn)結(jié)節(jié)及壞 死胚胎，對(duì)照組子宮未見異常。3討論HER2/neu 原癌基因編碼 P185 蛋白，主要在胚胎期的組織或器官中表達(dá)， 而在成年組織或器官極少表達(dá)， 因而機(jī)體免疫系統(tǒng)往往不能有效識(shí)別而導(dǎo)致免 疫耐受。 Disis等用完整 P185 蛋白不能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而多肽片段則可有 效誘導(dǎo)反應(yīng)，推測蛋白片段可能暴露了某些次要表位而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。基于以上這些觀點(diǎn)，我們選擇了 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)片段，一方面可能暴露部 分抗原表位

14、，又避免全長基因表達(dá)產(chǎn)物帶來的潛在轉(zhuǎn)化危險(xiǎn)。此外，人，大鼠 和小鼠的HER2/neu 基因高度同源，我們將人和大鼠的基因免疫小鼠，所得的結(jié) 果也較為可靠。從 1995 年以來，DNAS苗因?yàn)橹苽浜唵危４娣奖悖刹僮餍?強(qiáng)，成為免疫學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。3 HER2/neu ECD 基因免疫誘導(dǎo)特異抗體反應(yīng)Fig.3 Specific antibody response induced byHER2/neu ECD gene immunization本課題克隆并構(gòu)建了 HER2/ne u 胞外區(qū)片段，并經(jīng)測序鑒定。將含目的基因的質(zhì)粒 DNA 直接接種小鼠肌肉，檢測到目的基因的表達(dá)和抗HER2/ne

15、u 基因產(chǎn)物的抗體反應(yīng)。由于缺乏合適的體內(nèi)模型，選擇了小鼠流產(chǎn)模型作為體內(nèi)觀察指 標(biāo)，我們以前的研究表明，體內(nèi)的抗 P185 蛋白抗體可以誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)：印，當(dāng) 然在本課題研究中我們沒有研究細(xì)胞免疫是否也發(fā)揮了作用。我們的結(jié)果說 明，利用 HER2/neu 原癌基因胞外區(qū)片段免疫動(dòng)物可打破機(jī)體已有的免疫耐受， 并誘導(dǎo)出相應(yīng)的免疫應(yīng)答。這些結(jié)果提示，DNA 免疫，特別是包含潛在抗原表位的 DNAS苗，有可能打破機(jī)體原有的耐受，這在誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的 免疫應(yīng)答方面具有重要意義。何球藻(上海醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室 秦慧蓮(上海醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室 參考文獻(xiàn)1 ， Coussens L, Yang-

16、Feng TL, Chen YLE ， et al. Tyrosine kinase receptor withextensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neuoncogene. Science, 1985, 230: 11322，Kokay Y, Cohen JA, Drebin JA ，et al. Stage-and tissue-specific expression of neuoncogene in rat development. Proc Natl Acad Sci USA, 1987

17、, 84: 84983， Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neuprotooncogene in human breast and ovary cancer. Science, 1989, 244: 7074，Disis ML ，Calenoff E, McLaughlin G ，et al. Existent T cell and antibody immunityto HER-2/neu protein in patients with breast cancer. Cancer Res, 1994, 54: 165,李曉華，秦慧蓮，何球藻.原癌基因 HER2/neu 表達(dá)產(chǎn)物 p185 蛋白免疫原性研究. 中國免疫學(xué)雜志， 1998， 14： 1916， Bright RT, Shearer MH, Kennedy RC. Nucleic acid vaccination against virallyinduced tumors. Ann NY Acad Sci, 1995, 272: 241 7，Disis ML, Gralow JR, BernhardH ， et