1、九龍江水大腸菌群的測定周濤（閩南師范大學生科院食品科學與工程14級）摘要：本文通過多管發酵法測定水源水大腸菌群數量，初步發酵試驗檢測水源水存在大腸桿菌菌群，平板分離得到單一菌群群落，復發酵試驗通過革蘭氏染色確定為大腸菌群陽性結果。關鍵詞：九龍江水、大腸菌群、多管發酵法、初步發酵試驗、平板分離、復發酵試驗、革蘭氏染色、DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA JIULONG RIVER WATER Tao ZhouAbstract: In this paper, multiple tube fermentation method determined by the n

2、umber of coliform source water, preliminary fermentation tests detect the presence of E. coli bacteria source water, flat flora isolated single community, complex fermentation test by Gram stain identified as coliform positive results.Key words: Jiulong River water, coliform, multi-tube fermentation

3、 method, preliminary fermentation tests, flat separated, complex fermentation test, Gram stain,1 材料與方法1.1 基本原理多管發酵法包括初步發酵試驗、平板分離和復發酵試驗三個部分。1.1.1初步發酵試驗(48h ，需2天)發酵管內裝有乳糖膽鹽蛋白胨液體培養基，并倒置一德漢氏小導管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發酵乳糖，而大腸菌群能發酵乳糖而產生酸產氣。為便于觀察細菌的產酸情況，培養基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細菌產酸后，培養基即由原來的紫色變為黃色。溴甲酚紫還有抑制其它細菌如芽孢菌生長的

4、作用。水樣接種于發酵管內，37下培養，24h 內小套管中有氣泡形成，并且培養基渾濁，顏色改變，說明水中存在大腸桿菌，為陽性結果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產氣；此外產酸不產氣的也不能完全說明是陰性結果，在量少的情況下，也可能延遲48h 后才產氣，此時應視為可疑結果，因此，以上兩種結果均需繼續做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。48h 后仍不產氣的為陰性結果。1.1.2平板分離（1天，初發酵2天后做此實驗，此實驗第2天即可做革染） 平板培養基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂（遠藤氏培養基）或伊紅美藍瓊脂（EMB agar）,前者含有堿性復紅染料，在此作為指示劑，它可被培養基中的亞硫酸

5、鈉脫色，使培養基呈淡粉紅色，大腸菌群發酵乳糖后產生的酸和乙醛即和復紅反應，形成深紅色復合物，使大腸菌群落變成為帶金屬光澤的深紅色。亞硫酸鈉還可以抑制其他雜菌的生長。伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅美藍染料，在此作為指示劑，大腸菌群發酵乳糖造成酸性環境時，該兩種染料即結合復合物，使大腸菌群產生與遠藤氏培養基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的銅綠色深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發酵管24h 內產酸產氣（陽性結果）和48h 產酸產氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。1.1.3復發酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經涂片染色為革蘭氏陰性芽孢桿菌者，通過此試驗再進一步證實。原理與初發酵試驗相同，經24h 培養產酸又產氣的

6、，最后確定為大腸菌群陽性結果。1.2實驗材料和設備：器材：試管、吸頭（1ml、5ml）、冰箱、量筒、玻棒、燒杯、PH計、培養皿、水浴鍋（箱）、培養箱、試劑瓶、電磁爐、顯微鏡、錐形瓶、接種環、干燥箱、漢德氏管、高壓滅菌器、單道移液器、電子分析天平、培養基：乳糖膽鹽蛋白胨、伊紅美藍瓊脂（EMB） 1.3操作步驟（一）多管發酵（大腸菌群的測定）1.3.1水樣的采集：用高溫滅菌過的試劑瓶到九龍江取水，將瓶子連瓶蓋一起伸到10-15厘米的深處打開瓶塞，等水滿后蓋上蓋子后從水中取出。運送水樣時應避免玻璃瓶搖動，水樣溢出后又流回瓶中，從而增加污染。 1.3.2水樣的稀釋：將滅菌的三根試管各裝9ml的無菌水標

7、上1、2、3各組的記號。充分振蕩水樣，從中吸取1ml于1號試管中，充分振蕩即得1：1 0的稀釋液。同理配制1：100及1：1000稀釋液。1.3.3水源水的檢查 （1）從原水樣、1:10、1:100、1：1000的稀釋液各吸取1ml于4支經過滅菌的裝有10m乳糖膽鹽蛋白胨液體培養基中，內倒置一德漢氏小導管。（每吸取一次，吸頭都要換一次）。（2）將上述溶液混勻后，于36攝氏度培養24h，24h未產氣的繼續培養至48h。記錄其稀釋液的產氣管數，進行復發酵試驗。（3）平板分離經24h及48h 培養后，將產酸產氣的發酵管，分別劃線接種于相應稀釋梯度標簽的伊紅美藍瓊脂平板上，再于37下培養18-24h。

8、（4）復發酵試驗培養18-24h后，將符合下列特征（產酸產氣）的菌落的一小部分，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。經涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于乳糖膽鹽蛋白胨液體培養基中，37培養24h，結果若產酸又產氣，即證實有大腸菌群存在。證實有大腸菌群存在后，再根據初發酵試驗的陽性管（瓶）數查表，即得大腸菌群數表1：大腸菌群檢數表(嚴重污染水)（革陰性=表中+）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數備注10.10.010.001（即G+）<900接種水樣量為1.111(1,0.1,0.01,0.001個一份)+900+900+950+1800+1900+2

9、200+2300+2800+9200+-9400+18000+23000+96000+238000+>238000大腸菌群檢數表(中度污染水)接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數備注1010.10.01<90接種水樣量為11.11(10,1,0.1,0.01個一份)+90+90+95+180+190+220+230+280+920+940+1800+2300+9600+23800+23800大腸菌群檢數表(輕度污染水)接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數備注1001010.1<9接種水樣量為11.11(10,1,0.1,0.01個一份)+9+9+9.5+18+19+22+23

10、+28+92+94+180+230+960+2380+2380附錄：1.乳糖膽鹽蛋白胨液體培養基（本實驗采用合成培養基）乳糖 10g 蛋白胨 20g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL （配制時需加熱才能溶解）膽鹽 5g蒸餾水 1000mL將上述培養基成分溶解于1000mL蒸餾水中后（不能加熱），調pH7.27.4，加入0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，充分混勻，分裝于置有德漢氏導管的試管內。115滅菌15min。1.4 革蘭氏染色法1.4.1基本原理：革蘭氏染色法(Gram's staining method)是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫

11、師Gram創立。 革蘭氏染色法不僅用來觀察細菌的形態，而且它還是細菌鑒定的重要方法，可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類，是細菌學上最常用的鑒別性染色法。革蘭氏染色法的主要步驟是先用結晶紫進行初染；再加媒染劑-碘液，以增加染料與細胞間的親和力，使結晶紫和碘在細胞膜上形成分子量較大的復合物；然后用脫色劑(乙醇或丙酮)脫色；最后用蕃紅復染。凡細菌不被脫色而保留初染劑的顏色(紫色)者為革蘭氏陽性菌G+，如被脫色后又染上復染劑的顏色(紅色)者為革蘭氏陰性菌G-。有芽胞的桿菌和絕大多數和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無

12、芽胞桿菌都呈現負反應。 該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。1.4.2器材：1.菌種 大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物，金黃色葡萄球菌約24h營養瓊脂斜面培養物，蠟樣芽孢桿菌（B.cereus)1224h營養瓊脂斜面

13、培養物。2.染色劑：革蘭氏染色液。3.儀器及其他用具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙、生理鹽水等。14.3操作步驟：1.4.3.1制片（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中間加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：讓涂片在酒精燈火焰上方文火烘干。（3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）注意：要用活躍生產期的幼培養物做革蘭氏染色；涂片用的載玻片要潔凈無油污跡，否則影響涂片。挑菌量應少些，涂片宜薄，過厚重疊的菌體則不易觀察清楚。1.4.3.2 初染（1）結晶紫色染色：將玻片置于干凈的

14、培養皿上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結晶紫染色液染色1-2分鐘。（2）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。1.4.3.3媒染（1）用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1分鐘。（2）水洗：用水洗去碘液。1.4.3.4脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性細菌也可被脫色而被誤認為是革蘭氏陰性細菌。而脫色時間過短，革蘭氏陰性細菌則會被誤認為是革蘭氏陽性細菌。脫色時間的長短還受涂片的厚薄、脫色時玻片晃動的程度等因素的影響。脫色時間一般約20-30s。1.4.3.5復染（1）用番紅

15、復染約2分鐘。（2）水洗：用水洗去涂片上的番紅染色液。（3）晾干：將染好的涂片用吸水紙吸干。1.4.3.6鏡檢鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。2 總結與討論注意事項:1、在初步發酵試驗中，德漢室小導管倒置時，應先使液體斜面傾斜，再迅速把小導管倒入試管內，如果動作緩慢，則進入試管內的小導管會有氣泡，影響實驗結果判斷。2、在平板分離試驗中，手拿培養皿時注意靠近酒精燈，對接種環進行殺菌，否則，容易引入雜菌。3、革蘭氏染色中，注意初染、媒染、酒精脫色、復染的步驟順序，每一次染色都要用水沖洗至水流沒有顏色為止，每次染色都要保證染色時間12分鐘。4、顯微鏡觀察時，注意規范使用。問題與思考（1） 你認為制備細菌染色標本時，尤其應該注意哪些環節？答：制備適宜的培養