1、銀柱親和層析親和層析的原理：利用分子間存在特異性的相互作用，它們之間都能夠進行專一而 又可逆的結合，這種結合力就稱為親和力。常見具有專一性親和力的生物分子對：酶：基質類似物，抑制劑，輔酶抗體：抗原，病毒，細胞細胞：細胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸：互補堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細胞表面受體，細胞RFigure 1, Interaction between neighboring residues in the 6xHi$ 把慟 0nd Ni-NTA matrix.文獻將被固定在色譜基質上的分子稱為配體，配體和基質是共價結合的，構成親 和層析

2、的固定相，稱為親和吸附劑。配體以共價鍵結合到活化的基質上，構成固相載體 。一般載體采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝膠和纖維素等。amiciuxof e-咪睡環：是1, 3二氮雜戊環，英文名是 氮原子上去掉那個氫原子所剩余的部份， 原子直接相連的氫原子后剩下的部分Imidazole, 如果在第一位或第三位上的 就叫咪睡基。就是咪坐上去掉一個和氮HC-N/HC、NH組氨酸的性質：具有弱疏水性、咪唾環為弱電性。金屬離子：Cu2+k Ni2+、Zn2+、Co2將過渡金屬離子可與 N、S和。等供電原子 產生配位鍵，因此可與蛋白質表面的組氨酸（His）的咪唾基、半胱氨酸（Cys） 的琉基和色氨酸（

3、Trp）的呷咪基發生親和結合作用，其中以 His的咪唾基的結 合作用最強。過渡金屬離子與咪唾基的結合強弱順序是Cu2+> Ni2+ >Zn2+>Co2+ 。鍥離子：有六個螯合價位，通常將鍥柱分為了 Ni-NTA和Ni-IDA。Ni-NTA螯合了 四價，剩余兩價；而Ni-IDA螯合三價，剩余三價。因此 Ni-IDA Agarose結合作 用力要比Ni-NTA Agarose強，在同樣條件下Ni-IDA Agarose的載量要比Ni-NTA 高，而且洗脫雜質和目標蛋白所用的緩沖液中咪唾濃度更高； 但Ni-NTA更穩定， 耐受更強的還原劑，鍥離子更不易脫落。因此需要根據不同的純化條

4、件選擇純化基質：不溶性的多孔網狀結構，滲透性好；物理和化學穩定性高，有較高的機械強度，使用壽命長;抗微生物和酶的侵蝕；最好為粒徑均一的球形粒子；具有親水性，無非特異性吸附；含有可活化的反應基團，利于親和配體的固定化。例：瓊脂糖凝膠微球的商品名為 Sepharose,含糖濃度為2% 4% 6%寸分別稱為2B、4R 6B。Sepharose 4B的結構比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應 用最廣。配基：是可以可逆結合特定分子或特定基團的分子， 能夠通過親和色譜的方式進 行純化。配基的選擇受到兩種因素的影響：(1):配基與目標物的結合必須具有特異性 和可逆。(2):必須具有化學修飾基團，使它吸

5、附在基質上，并且不損害它的活性。間隔臂：目標蛋白質的結合位點位于分子中較深的部位， 如果將配基直接偶聯到 基質上，受到空間位阻的影響，配基不能到達目標蛋白的結合位點， 因此與目標 蛋白的結合能力低。于是在配基與基質之間插入一個間隔臂可以使結合更加容 易。間隔臂使結合最大化的同時要避免非特異性結合。間隔臂的長度是關鍵，太短，無效；太長，發生非特異性結合。一般規則：偶聯 的分子量小于1000時使用間隔臂；當大分子量，則不一定要。二硫鍵：蛋白質的的二硫鍵在半胱氨酸殘基的硫醇之間形成，包內蛋白離開細胞后， 二硫鍵常以氧化狀態存在。此鍵在蛋白質分子的立體結構形成上起著一定的重要作用。為了確定蛋白質的一級

6、結構，首先必須將二硫鍵打開，使成為線狀多肽鏈。上樣方式：(1)直接上樣(2)間接上樣洗脫方式：(1) pH值洗脫：pH的改變可以改變帶電荷的配基基團和結合蛋白的離子化程度，使它們結合位點的親和性降低。(降低 pH的方法)(2)離子強度洗脫：(3)競爭性洗脫：(咪唾)再生：(1)先用強變性劑6M鹽酸月瓜沖洗柱子(2)用水沖洗干凈(3)0.2%SDS沖洗柱子(4)用水沖洗干凈(5)50%乙醇沖洗柱子(6)用水沖洗干凈用 100mM EDTA(50mM Tris 100mM EDTA PH 8.0)沖洗柱子(8)用水沖洗干凈(9)用100mM硫酸饃孵育柱子(10)20%乙醇中4 c保存上清緩沖液及配

7、方上清純化緩沖液Lysis Buffer50mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 20mM Imidazole； pH8.0;Elution Buffer 150mM Tris-HCl; 150mM NaCl; 50mM Imidazole； pH8.0;Elution Buffer 250mM Tris-HCl ; 150mM NaCl; 100mM Imidazole； pH8.0;Elution Buffer 350mM Tris-HCl ; 150mM NaCl; 300mM Imidazole； pH8.0;包涵體緩沖液及配方包涵體純化緩沖液配方IB Lysis Buff

8、er 120mM Tris； 150mM NaCl; 2mM EDTA ; 2mMDTT ;1% Triton X-100; PH8.0;IB Lysis Buffer 250mM Tris-HCl; 150mM NaCl ; 8Murea； pH8.0;IB ElutionBuffer150mM Tris-HCl150mMNaCl ； 20mMimidazola；8Murea；pH8.0;IB ElutionBuffer250mM Tris-HCl150mMNaCl ； 50mMImidazola；8Murea；pH8.0;IB ElutionBuffer350mM Tris-HCl150m

9、MNaCl ； 100mMImidazola；8Murea；pH8.0;IB ElutionBuffer450mM Tris-HCl150mMNaCl ； 300mMImidazola； 8Murea；pH8.0;IB ElutionBuffer550mM Tris-HCl150mMNaCl ； 500mMImidazola； 8Murea；pH8.0;試劑及作用1 .TritonX -100（曲拉通）：具親水端和疏水端，可將膜蛋白從細胞膜上解離下來， 達到提取膜蛋白的作用。常用的非離子性去垢劑。用量： 1%-3%TritonX -1002 .TCEP （三（2-竣乙基）麟）：是一種非常有效的

10、硫醇類還原劑，廣泛用作蛋白質 化學及蛋白質組學研究中二硫鍵的定量還原劑。 該試劑在水溶液中的穩定性和溶 解性都很好。在酸性、堿性溶液中的穩定性也不錯。與其他類別的硫醇類還原劑 如DTT相比，TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在某些琉基的交聯 反應中不需要除掉。用量：1mM/ml.3 .Pepstatin（胃蛋白酶抑制劑）：抑制酸性蛋白酶，配置時溶于甲醇中，在水中不 溶解。用量：1ug/ml。Store at:-4c （A week） /-20C （Half a year）。4 .Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：抑制絲氨酸和琉基蛋白酶，配置時溶于水，用量: 1ug/mL Store

11、at:-4c （A week） /-20C （Half a year）。5 .EDTA （乙二胺四乙酸）：螯合劑，消除微量重金屬導致的酶催化反應中的抑 制作用。不影響蛋白質功能的情況下去除干擾金屬離子，但是同時能使金屬蛋白酶喪失活性。用量：0.15mmol/L。6Glycerolft油）：增加黏度，減少分子間的碰撞，用量：5%-30%。6 .SDS（十二烷基硫酸鈉）：能夠使蛋白質變性的陰離子型去污劑，用量：0.1%-1%。8 .TritonX -114（曲拉通）：溫度在22c以上時，在蛋白質溶液中加入 2%的TritonX -114可使蛋白質從去垢劑相和液相中分離， 可溶性蛋白在液相中，而膜蛋白則進 入了去垢相中。（內毒素存在于細胞壁組分，菌裂解后釋出物中。）9 .DTT （二硫蘇糖醇）：常常被用于蛋白質中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質 中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間