1、高效液相色譜和氣相色譜的異同點不同點：一、流動相不同：HPLC為液體流動相，GC為永久性氣體作流動相（通常叫做載氣）二、進樣器不同：高效液相為平頭進樣針，氣相色譜為尖頭進樣針三、色譜柱長不同： （1）氣相色譜柱通常幾米到幾十米（氣相色譜由于載氣的相對分析量較低，分子間隙大，故粘度低，流動性好，組分在氣相中流動速度快，因此可以增加柱長，以提高柱效）。（2）液相色譜柱通常為幾十到幾百毫米四、分析種類有差異：氣相色譜分析的對象多為（不適絕對）：分子質量小于1000，低沸點，易揮發，熱穩定性好的化合物。液相色譜：更適用于分析高沸點，難揮發，熱穩定性差，分子質量較大（1000 - -2000）的液體化合

2、物。五：樣品柱前變化不同：氣相色譜的樣品在柱前必須變為氣體（氣化室汽化），而液相色譜的樣品在柱前則無變化。六、所用檢測器有差異：液相主要為：紫外檢測器，熒光檢測器、示差折光檢測器.氣相色譜主要為：氫火焰離子化檢測器（FID）,熱導檢測器（TCD）,電子捕獲檢測器（ECD）,火焰光度檢測器（FPD）,氮磷檢測器（NPD）.相同點：基本原理相同。都是利用物質在流動相和固定相中的分配系數的差別，從而在兩相間反復多次（1000-1000000次，甚至更多）的分配，使原來分配系數差別很小的各組分分離開來。v Owen發現異卵雙生牛的天然免疫耐受現象(1945)，明確自身識別問題，伯耐特(Burnet，1

3、949)提出免疫耐受理論，梅德華(Medawar，1953)實驗證實胚胎期耐受理論。耶那(Jerne，1955)提出天然抗體選擇學說，完成免疫網絡學說(1974)，伯耐特等(Burnet & Talmage, 1957)完善克隆選擇學說等免疫防御(immunologic 抗感染 defense) 免疫穩定(immunologic 消除炎癥或衰老細胞 homeostasis) 免疫監視(immunologic 控制癌變細胞 surveilance)1高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達1503.5萬K

4、Pa。 2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達110ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。 4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。 5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成

5、溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大于 400 以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數的 75% 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占7080%。 高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復性好，且

6、須在色譜儀中進行。 編輯本段主要類型及其分離原理根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型： 1 液 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于下式： 式中，cs溶質在固定相中濃度；cm-溶質在流動相中的濃度； Vs固定相的體積；Vm流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即

7、分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小于固定液的極性。 b. 反相液 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大于固定液的極性。 c. 液 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見后），可克服上述缺點。現

8、在應用很廣泛（7080%）。 2 液 固色譜法 流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa = Xa + nSm 式中：Xm-流動相中的溶質分子；Sa-固定相中的溶劑分子；Xa-固定相中的溶質分子；Sm-流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=XaSm/XmSa 式中：K為吸附平衡常數。討論：K越大，保留值越大。 3 離子交換色譜法(Ion-exchange C

9、hromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。 以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)= (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=-R4N+ X- Cl-/-R4N+Cl- X- 分配系數為： DX=-R4N+ X-/X-= KX -R4N+Cl-/Cl- 討論：DX與保留值的關系 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。 4 離子對色譜法

10、(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 = X+Y-有機相 式中：X+水相-流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相-流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y-形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = X+Y-有機相/ X+水相Y-水相 根據定義，分配系數為： DX= X+Y-有機相/ X+水相= KX

11、Y Y-水相 討論：DX與保留值的關系 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。 5 離子色譜法(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的

12、逆過程）： 抑制柱上發生的反應： R-H+ + Na+OH- = R-Na+ + H2O R-H+ + Na+Br- = R-Na+ + H+Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽離子分析。 6 空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來

13、進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現。 高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。 1進樣系統 一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。 2輸液系統 該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度

14、儀三部分。高壓泵的一般壓強為l4744X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。 3.分離系統 該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為1050cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為25mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料

15、制成，住內裝有直徑為510m粒度的固定相（由基質和固定液構成）固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。 另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態，極易降低渦流擴散效應?；|粒度小，微孔淺，

16、樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。 再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。 4檢測系統 高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。 （1）紫外檢測器 該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g/ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣

17、品。 （2）示差折光檢測器 凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。 （3）熒光檢測器 凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-1210-14g/ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。 （5）數據處理系統

18、 該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。 編輯本段操作注意要點1) 首先對流動相進行過濾，根據需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。 2) 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。 3) 正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鐘，然后再進入測試用流動相(如流動相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機相沖凈為止) 。 4) 一般情況下，流動相沖洗20-30分鐘后，儀器方可穩定，最重要的是儀器基線走后，方可進樣測試。 5) 同時進兩針標樣，將其結果相比較，其結果的比值在0.98-1.02之間后，就可以正式進行樣品的測試了。 6) 樣品測試結束后，就要進行色譜儀及