1、細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（ MMP-2 ）活性免疫捕獲定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）主要用途細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（ MMP-2）活性免疫捕獲定量檢測試劑是一種旨在通過使用MMP-2特異性抗體捕獲樣品中的MMP-2抗原蛋白，識別并切離人工合成含硫多肽，釋放出巰基，進而使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色 5-巰基 -2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，來測定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶2 的特異活性定量檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。技術(shù)背景基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix

2、 metalloproteinases ；MMPs ）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的 MMPs 至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細胞外基質(zhì)（ extracellular matrix ）成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs 分為 4大類：（ 1）膠原酶： MMP1 、MMP8 、 MMP13 主要消化、型膠原和蛋白多糖；（2）明膠

3、酶（型膠原酶） ：MMP2 、MMP9 ，又稱明膠酶 A 、 B ，主要消化、 、型膠原和彈性纖維； （3）基質(zhì)溶解素： MMP3 、MMP7 、MMP16 、MMP11 、MMP12 ，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、膠原及MMP1 、MMP8 、MMP9 ；（4）膜型金屬蛋白酶：MT 1-MMP 、 MT 2-MMP 、MT 3-MMP ，主要作用于明膠、型膠原、 MMP2 。體內(nèi)絕大多數(shù)細胞并不儲備MMPs ，當需要 MMPs 的信號傳遞到細胞后才臨時合成，合成的MMPs 以無活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細胞外， 隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，

4、一種激活的 MMPs可激活另一種 MMPs ，形成瀑布效應(yīng)。 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 ，又稱明膠酶 A （ gelatinase-A）或 IV 型膠原酶（typeIV collagenase），其前體分子量為XX ，激活后分子量為XX 和 XX 。它在血清或細胞上清中濃度通常為10至200納克 /毫升。它的作用目標是天然和變性膠原蛋白（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin ）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連蛋白-5（laminin-5 ）、前體腫瘤壞死因子-（pro-TNF- ）和神經(jīng)（蛋白）聚糖（neurocan）。基質(zhì)金屬蛋白酶-2與腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移、血管形成、動脈

5、粥樣硬化等疾病有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性檢測通過使用MMP-2 特異性抗體涂板在孔板里的相應(yīng)孔里，然后捕獲樣品中的MMP-2 抗原蛋白，在膠原酶潛酶活化劑醋酸氨基苯汞（ 4-aminophenylmercuric acetate ；APMA ）的存在下，識別并切離人工合成含硫多肽 （thiopeptide ）底物 Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl ）-LG-OC 2H 5，釋放出巰基 （sulfhydrylgroup），進而與 Ellman 試劑 5,5-二硫基 -雙（ 2-硝基苯甲酸） 5,5 -dithiobis- （2-nitrobenzoic

6、acid ）；DTNB 反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的 5-巰基 -2-硝基苯甲酸 （5-thio-2-nitrobenzoic acid ；TNB ），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量測定組織基質(zhì)金屬蛋白酶2的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：產(chǎn)品內(nèi)容清理液（Reagent A）XX 毫升裂解液（Reagent B）XX 毫升抗體液（緩沖液（封阻液（激活液（反應(yīng)液（標準液（稀釋液（Reagent C）Reagent D）Reagent E）Reagent F）Reagent G）Reagent H）Reagent I）XX 毫升XX 毫升XX 毫升XX 毫升XX 毫升XX 微升XX 毫升產(chǎn)品說明書1

7、 份保存方式保存標準液（ Reagent H）在-70 冰箱里；保存抗體液（ Reagent C） 激活液（Reagent F）和 反應(yīng)液（ReagentG）在 -20冰箱里，其余的保存在4冰箱里；有效保證3 月用戶自備1.5 毫升離心管：用于標準樣品配制和樣品保存的容器15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞（微型）臺式離心機：用于樣品操作培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育酶標板：用于反應(yīng)分析的容器酶標儀：用于比色分析實驗步驟實驗開始前，將20冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。一、樣品準備1準備好 25cm2 細胞培養(yǎng)瓶或60mm 細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 至

8、5 X 10 6 細胞）2小心加入 XX 毫升清理液（ Reagent A），覆蓋生長表面3小心抽去清理液4使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化 ）5加入 XX 毫升清理液（ Reagent A），混勻細胞6移入到預冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始 ）7放進 4臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g8小心抽去上清液9加入 XX 微升裂解液（ Reagent B），充分混勻10 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5 毫升離心管11強力渦旋震蕩15 秒12 置于冰槽里孵育30 分鐘13 放進 4微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為16000g（或 13000RPM ，例如 eppe

9、ndorf 5415）14 小心移取 500 微升上清液到新的預冷的1.5 毫升離心管15 移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒MB30030.1 ）16 使用稀釋液（ Reagent I）調(diào)節(jié)蛋白濃度為XX 毫克 / 毫升17 即刻放進 70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測定準備1 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里2 設(shè)定好酶標儀（溫度為37）：波長 412nm三、 標準樣品配制1 準備好 5個 1.5 毫升離心管，標記為 1 至 5 號管2 分別加入XX 微升 稀釋液（ Reagent I）到 1 至 5 號管3 移取

10、 XX微升 標準液（ Reagent H）到 1 號管，混勻4 小心移取XX 微升 1 號管稀釋的標準液（ Reagent H ）到 2 號管，混勻5 小心移取XX 微升 2 號管稀釋的標準液（ Reagent H ）到 3 號管，混勻6 小心移取XX 微升 3 號管稀釋的標準液（ Reagent H ）到 4 號管，混勻7 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表管號稀釋液（ Reagent I）標準液（ Reagent H）標準 MMP-2 濃度1XX 微升XX 微升XX 納克 /毫升2XX 微升XX 微升1號管XX 納克 /毫升3XX 微升XX 微升2號管XX 納克 /毫升4XX 微

11、升XX 微升3號管XX 納克 /毫升5XX 微升00四、樣品測定1 在酶標板上做好相應(yīng)標記：標準樣品、樣品活性2 分別移取 XX 微升抗體液（ Reagent C）到酶標板的相應(yīng)孔里3 放進 4冰箱里孵育16 小時（或室溫下孵育2 小時）4 小心抽去抗體液（ Reagent C），確保無液體殘留5 分別加入 XX 微升緩沖液（ Reagent D）6 小心抽去緩沖液（ Reagent D），確保無液體殘留7 重復實驗步驟5 至 6 一次8 分別加入 XX 微升封阻液（ Reagent E）9 室溫下孵育60 分鐘10小心抽去封阻液（ Reagent E），確保無液體殘留11分別加入XX 微升緩

12、沖液（ Reagent D）12小心抽去緩沖液（ Reagent D），確保無液體殘留13重復實驗步11 至 12 一次14分別加入XX 微升上述配制的標準液 和待測樣品（ 100 微克蛋白總量）到相應(yīng)孔里15放進 37培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘16小心抽去標準液 和待測樣品，確保無液體殘留17分別加入XX 微升緩沖液（ Reagent D）18小心抽去緩沖液（ Reagent D），確保無液體殘留19重復實驗步17至 18三次20分別加入XX 微升激活液（Reagent F）21放進37培養(yǎng)箱里孵育120 分鐘22小心抽去激活液（Reagent F），確保無液體殘留23分別加入XX 微升反應(yīng)液（

13、Reagent G）24放進37培養(yǎng)箱里孵育60 分鐘（注意：如果活性過低，可以延長孵育時間至6 小時）25即刻放進酶標儀（412nm 波長）檢測，獲得吸光讀數(shù)26構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y 軸）為吸光讀數(shù)OD ；橫座標（27根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)MMP2 濃度（納克 / 毫升）X 軸）為標準MMP2濃度（納克/毫升）五、計算樣品活性單位XX注意事項1 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括標準液2 本產(chǎn)品的檢測敏感度為 1 納克 /毫升3 操作時，須戴手套4 系統(tǒng)操作過程中，標準液測定只需1 次5 樣品準備要點如下：a) 樣品中避免使用 EDTA 、 EGTA 等二價陽離子鰲和劑b)樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）c)如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑 （建議使用膠原酶潛酶活化劑 （ APMA MB12197 ）6 待測樣本為總蛋白，其蛋白濃度為100 微克 /100 微升（本公司提供Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒MB30030