1、抗體的純化第一節硫酸銨沉淀法基本原理硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。 用此方法可以將主要的免疫球蛋白從樣品中分離， 是免疫球蛋白分離的常用方法。 高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同， 因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。 這種方法稱之為鹽析。 鹽濃度通常用飽和度來表示。 硫酸銨因其溶解度大， 溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用最廣。試劑及 儀器·組織培養上清液、血清樣品或腹水等·硫酸銨（ NH4 ） SO4·飽和硫酸銨溶液（SAS）

2、·蒸餾水·PBS(含 0.2g/L 疊氮鈉 ) ( 見附錄一 )·透析袋·超速離心機·pH 計·磁力攪拌器實驗步驟以腹水或組織培養上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為33% 50% 。一、配制飽和硫酸銨溶液（SAS）將 767g （ NH4 ）2SO4 邊攪拌邊慢慢加到 1 升蒸餾水中。用氨水或硫酸調到 pH7.0 。此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液（ 4.1 mol/L, 25 °C）；其它不同飽和度硫酸銨溶液的配制見表1；精選文庫二

3、、沉淀1、樣品（如腹水）20 000 離g心 30 min ，除去細胞碎片；2、保留上清液并測量體積；3、邊攪拌邊慢慢加入等體積的SAS 到上清液中，終濃度為1： 1 （ v/v ）；4、將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6 小時或攪拌過夜（4 °C），使蛋白質充分沉淀。三、透析1、蛋白質溶液 10000 離g心 30 min （ 4°C）。棄上清保留沉淀；2、將沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS-0.2g/L疊氮鈉中。 沉淀溶解后放入透析袋對 PBS-0.2g/L疊氮鈉透析 24-48小時（ 4°C），每隔 3-6小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；3、透析液離

4、心，測定上清液中蛋白質含量。應用提示一、先用較低濃度的硫酸氨預沉淀，除去樣品中的雜蛋白。1、邊攪拌邊慢慢加SAS 到樣品溶液中，使濃度為0.5:1 (v/v)；2、將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6 小時 或過夜（ 4 °C）；3、 3000 g離心 30 min （ 4 °C），保留上清液；4、上清液再加SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5、雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時，用預沉淀除雜蛋白是非常有效的；二、為避免體積過大，可用固體硫酸氨進行鹽析（硫酸氨用量參考表1 ）；三、硫酸氨沉淀法與層析技術結合

5、使用，可得到更進一步純化的抗體。參考文獻1、 Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure forpurifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAEdisk. Hybridoma-2精選文庫12, 135.2、 T.G. 庫珀著，徐曉利主譯生物化學工具人民衛生出版社出版（1980 ）， 353 。（夏泉）表 1. 室溫下硫酸氨飽和度由起始濃度（S1）提高到終濃度（S2）時需加硫酸氨的量（g/L ）0%1

6、0%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%-3精選文庫56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 76757 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 64929 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 61930 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58319 30 62 94 12

7、7 162 198 235 273 314 356 449 54612 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 50631 63 97 132 168 205 245 285 375 46932 65 99 134 171 210 250 339 43133 66 101 137 176 214 302 39233 67 103 141 179 264 35334 69 105 143 227 31434 70 107 190 27535 72 153 23736 115 198

8、77 15779第二節DEAE 離子交換層析法基本原理離子交換層析是蛋白質純化的常規方法，與硫酸氨沈淀法聯合使用可以非常有效地純化抗體。DEAE 是一種陰離子交換劑， 當蛋白質溶液通過 DEAE 柱時，帶負電荷的蛋白質可以被 DEAE 吸-4精選文庫附，帶正電荷的蛋白質則不被吸附而隨溶液流出。純化抗體時可選擇pH 值大于待純化抗體等電點的緩沖液， 此時抗體帶負電荷可以通過電價鍵吸附于DEAE 離子交換劑上， 然后用增加鹽濃度的方法將抗體洗脫。可以用連續梯度法洗脫，也可以用不連續梯度（分段洗脫）法洗脫。本文以腹水中 mAb 的純化為例來介紹此方法。試劑及 儀器·抗體樣品（小鼠腹水或經硫

9、酸氨沉淀的抗體）·DEAE 離子交換劑（陰離子交換劑）·層析柱（ 2.5cm? 20 cm）·緩沖液A： 25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl·緩沖液B： 25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl·緩沖液C： 25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +500 mmol /L NaCl·緩沖液D： 25mmol/L Tris-HCl pH 8.8·PBS ( 見附錄一 )·透析袋(MW CO 10 000)·磁力

10、攪拌器·蠕動泵和部分收集器·紫外檢測儀·梯度發生器·電導儀·pH 計·離心機-5精選文庫實驗步驟整個層析過程最好在4°C 進行 ,可在冷室操作；1、抗體樣品對緩沖液B 透析過夜（ 4 °C）；2、按說明處理DEAE 離子交換劑。然后用緩沖液A 平衡。用 20 倍體積緩沖液A 洗交換劑，可用過濾或離心法反復洗到流出液的電導率等于緩沖液A；3、將處理好的DEAE 離子交換劑懸浮在緩沖液A 中，裝入層析柱。4、用等體積的緩沖液D 稀釋透析過的抗體樣品，使之與緩沖液A 的離子強度一致；5、稀釋后的樣品10 000 離g心

11、10 min （ 4 °C），除去沉淀變性的蛋白質；6、層析柱與蠕動泵、部分收集器及紫外檢測儀連接；7、抗體樣品以 1ml/min 流速上柱， 然后用緩沖液 A 洗柱 1ml/min ，將未吸附的蛋白質洗出。直到流出液在 280 nm 的吸光度小于 0.05 ；8、吸附的蛋白質， 用連續增加 NaCl 的濃度來洗脫。 用線性梯度緩沖液 （ 35-500 mmol/L NaCl ）或分段緩沖液（ 35 、 70、 140 、 280 、 500 mmol/L NaCl ）洗脫。流速 1ml/min ，分部收集洗脫液2ml /管 （圖 2-4-1 ）；9、椐紫外檢測結果，將抗體峰部分合并

12、。裝入透析袋對PBS(含 0.2g/L 疊氮鈉 )4 ° C透析或冷凍（視抗體的穩定性而定）；10 、 DEAE 離子交換劑可按照商品說明再生使用。圖 2-4-1 DEAE 離子交換柱層析純化小鼠IgG流速： 1ml/min樣品： 0.5ml 腹水檢測方法1、大部分小鼠的單克隆抗體IgG 可在 50200mmol/L NaCl濃度之間洗脫。2、可用 SDS-PAGE 或定量免疫學方法（RIA 、ELISA）檢測各部分洗脫液的抗體存在及效價。實驗要點及說明-6精選文庫1 、要得到滿意的分離結果，每ml DEAE 離子交換劑所加樣品中蛋白質總量最好不超過10mg 。2、用經硫酸銨沉淀初步

13、純化的抗體代替小鼠腹水作為樣品，可得到更好的純化結果。3、如抗體與DEAE 離子交換劑不能有效的結合，可將起始緩沖液的pH 提高 0.1 個單位 , 直到可以有效結合為止。4、如果沒有合用的蠕動泵和部分收集器，可用手工上樣和收集。洗脫液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度計測定各管280nm 波長的吸光度值。5、該方法可按比例擴大。用適合于高流速的大柱和相應的交換劑來純化大量的蛋白質樣品。參考文獻1. Corthier , G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purificatio

14、n from various animal species by ion exchange chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、張保真編譯西安醫科大學出版（1986 ）免疫組織化學理論與技術69-71 。（夏泉）第三節羥磷灰石層析純化抗體基本原理羥磷灰石 Ca10(PO4)6(OH)2 吸附蛋白質的機理， 通常認為與其晶體表面的 Ca2+ 和 PO43-兩種基團相關。 因為帶電基團緊密排列于晶體表面， 可能通過偶極子之間的相互作用來吸附蛋白質。樣品被吸附劑吸附后，用適當的洗脫液（較高濃度的鹽溶液）沖洗，可使之解析。解析下來的物質在流經層析

15、柱的過程中向前移動，遇到前面新的吸附劑可再被吸附。在反復的吸附 解析 再吸附 再解析的過程中，由于待分離物質與吸附劑之間的吸附能力不同，它們沿洗脫液流動方向移動的速度也不相同，所以在洗脫過程中各組分便會由于移動速度不同而被分離。抗體與其它蛋白質一樣可以用羥磷灰石吸附柱層析進行純化。-7精選文庫試劑 及儀器·抗體樣品（腹水或培養上清液）·羥磷灰石（ Hydroxylapatite有售）·層析柱（ 2.5cm? 20 cm）·吸附緩沖液：20mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.8 含 30mmol /L NaCl·洗脫緩沖液：500mmol/L磷酸鉀緩

16、沖液pH6.8含 30mmol /L NaCl·PBS ( 見附錄 1)·透析袋(MW CO 10 000)·磁力攪拌器·蠕動泵和部分收集器·紫外檢測儀·梯度發生器·離心機實驗步驟1、羥磷灰石柱的準備：將羥磷灰石懸浮于吸附緩沖液中，使之充分水合后裝柱。用10 柱體積的吸附緩沖液洗柱；2、樣品的預處理：含抗體的樣品先在4 °C對吸附緩沖液透析過夜或用該緩沖液10 倍稀釋，再將透析或稀釋后的樣品4 000 g 離心 15min （4°C）；3、儀器安裝：將蠕動泵、紫外檢測儀和部分收集器與層析柱連接；4、上樣：

17、將樣品上清液以1ml/min的流速加到柱上， 然后用 20 柱體積的吸附緩沖液洗柱；5、抗體的洗脫：提高磷酸鹽的濃度可以將抗體洗脫。常用的方法有兩種：一種是用梯度發生器進行線性濃度梯度洗脫，濃度為20500 mmol/L的磷酸鉀緩沖液；另一種方法是用不連續濃度梯度洗脫，例如可以用 35、 70、 140 、 280 和 500 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液依次分段洗脫。收集洗脫液 2ml / 管（圖 2-4-2 ）；6、合并洗脫液中含抗體的部分（見下面檢測）對PBS 透析。根據抗體的穩定性4 °C或冷凍-8精選文庫防腐（ 0.2g/L疊氮鈉）保存；圖 2-4-2羥磷灰石柱層析純化單克

18、隆抗體IgG流速： 1ml/min樣品：腹水1ml檢測方法1、 單克隆抗體IgG 通常在 200 400mmol/L磷酸鉀濃度之間洗脫。2、 可用 SDS-PAGE 或定量免疫學方法（RIA 、 ELISA），檢測各部分洗脫液的抗體。應用提示1、每 100ml 羥磷灰石可吸附大約 500 ml 細胞培養上清液或 3 ml 的腹水或血清中所含的抗體。2、使用羥磷灰石柱較適合的 柱長 / 直徑 可以在 5/1 15/1 之間（典型尺寸： 2.5cm ? 20 cm 柱長）。3、在吸附過程中應避免有對鈣的親和力大于磷酸鹽的物質（如EDTA 和檸檬酸等）的存在，以免減少羥磷灰石的吸附容量。4、用過的羥

19、磷灰石柱可以用吸附緩沖液平衡再生后重復使用。或加入甲苯（0.03% ， v/v)或疊氮鈉（ 0.2g/L ）儲存。5、如果沒有合適的蠕動泵和部分收集器，可手工加樣和收集洗脫液2ml /管，并用分光光度計測定各管在280nm波長的吸光度。6、與本方法類似的吸附和洗脫過程也可用來純化其它蛋白質。參考文獻Bukovsky, J. and Kennett, R.H. (1987) Simple and rapid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydro

20、xylapatite chromatography on analytical and preparative scales. Hybridoma 6 ,219-228.（夏泉）第四節抗體的辛酸純化法基本原理-9精選文庫在人、羊或兔血清或含有 IgG 的培養上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可與其中大部分蛋白質形成沉淀，而對IgG 的性質沒有影響，因此是純化IgG 的有效途徑。沉淀后經離心即可獲得 IgG 。辛酸沉淀法與硫酸銨沉淀法比較其主要優點為可減少聚合物的形成，但與其相同，所得的抗體純度不夠，還需用其它方法以進一步提高其純度。試劑 及儀器s 腹水或細胞培養上清s 0.06 mol/L醋酸鈉

21、緩沖液（pH4.0 ）（見附錄1 ）s 1N HCls 辛酸（正 -八碳酸， n-octanoic acid）s 1N NaOHs PBS（見附錄）s 透析袋（ MWCO 10,000 ）s 電磁攪拌器s 離心機操作步驟1 用燒杯加 20ml 0.06 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.0 ）到 10ml 腹水或細胞培養上清中；2 用 1N HCl 調節 pH 到4.8 ，后滴加辛酸同時用力攪拌，具體用量參見表1；3 在室溫下繼續攪拌 30分；4 5， 000 ×g 室溫離心30 分，保留上清；5 用 1N NaOH 調節 pH 到 5.7 ；6 含有 IgG 的上清對 PBS 透析，

22、然后分裝、置-20 保存。表 1 沉淀不同來源 IgG 的辛酸參考用量IgG 來源 辛酸用量（每 10ml 腹水或上清）-10精選文庫小 鼠 400l人 700l 羊 700l 兔 750l質量檢察上清中 IgG 的純度可用SDS-PAGE 分析及合適的酶標免疫測試法測定其免疫活性來確定。上清中可能存在少量雜質，可通過DEAE 離子交換層析除去。參考文獻1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purification of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipi

23、tation. J. Immunol. Meth. 65,269-2712.（朱正美）第五節Sephadex 凝膠過濾純化抗體基本原理凝膠過濾又稱分子篩層析。是一種借助分子篩效應將分子大小不同的混合物進行分離的方法。交聯葡聚糖凝膠Sephadex 是常用的層析介質。它是一種含有許多網眼的球形小顆粒，網眼大小分布均一。當分子大小不同的混合物通過凝膠柱時，其中較大的分子不能進入凝膠網眼， 將毫無阻力或阻力很小地隨洗脫液流出，而小分子物則能擴散進入網眼，被阻滯在層析柱上， 分子量越小， 擴散出來所耗時間就越長。因此分子大小不同的MoAb 可以借助分子篩效應進行分離提純。本文以IgM 的純化為例介紹此

24、方法。IgM 因分子特別大（900 kd ）而不能進入凝膠顆粒的網孔，可首先被洗脫達到初步純化的目的。試劑和器材·Sephadex G 100或 G 200·粗制 IgM-MoAb 培養物或抗血清，腹水等-11精選文庫·洗脫緩沖液：0.01mol/L Tris-HCl緩沖液 pH 8.0含 0 .5mol /L NaCl·層析柱（ 1.0 cm? 30 cm或 1.5cm? 40 cm）·透析袋(MW CO 10 000)·磁力攪拌器·部分收集器·紫外檢測儀·離心機步驟1、 樣品處理：將腹水、抗血清或培養

25、上清液離心4000 g20 分鐘，以除去細胞碎片。較稠的腹水和血清需適當稀釋；2、裝柱：根據樣品量選擇合適的層析柱， 將 0.01mol/L pH 8.0 含 0 .5mol /L NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液加到柱長的 1/4 處，然后將漂洗溶漲的 Sephadex G 100 或 G 200 傾入柱中，自然沉降 30 分鐘，再用同樣的緩沖液平衡柱1 小時，流速0.5ml/min ；3、 儀器連接：將紫外檢測儀和部分收集器與層析柱連接；4、 上樣和洗脫：待柱上平衡緩沖溶液接近凝膠上表面時，緩慢加入樣品溶液0.5ml/min 。當樣品液面接近凝膠上表面時，加少量緩沖液清洗柱壁，然后接

26、上緩沖液洗脫并收集1-2ml/ 管。 280nm檢測的第一蛋白峰即為IgM-MoAb 。5、濃縮與保存： 將 280nm 檢測的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力攪拌器上4 °C對 PBS流動透析過夜。 透析后的溶液可經聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥濃縮后，分裝封管， -20 °C保存備用。檢測1、可用 SDS-PAGE 或定量免疫學方法（RIA、 ELISA）檢測各部分洗脫液的抗體。2、 IgM-MoAb一般在外水體積洗脫。應用提示1、凝膠過濾不變換洗脫液，一次裝柱后可反復使用多次。操作簡單，快速經濟。-12精選文庫2、實驗可重復性高，樣品回收幾乎可達100% ，且方法溫和，

27、不易引起生物樣品變性失活，可進行大量樣品的分離純化。3、用于小分子物（如無機鹽）從大分子物（MW>20 000 ）分離的層析柱，柱體積應大于樣品體積 4-10 倍，其高與直徑的比例應為5:1-15:1 ；用于大分子物之間的分離（如免疫球蛋白之間的分離），則柱體積應大于樣品體積25-100 倍，高與直徑的比例應為20:1-100:1 。4、 Sephadex 凝膠裝柱時，應灌制均勻無斷層和氣泡。在整個操作過程中，凝膠應始終保持在液面以下。5、提取的IgM 濃度過低或反復凍融會引起變性，應分裝后在-70 °C或 -20 °C凍存，或者加0.2g/L 疊氮鈉在4 °

28、;C可保存數月。6、如無合用的部分收集器，可手工收集1-2ml/ 管，用分光光度計測定各管吸光度值。參考文獻1、 周本正編著 層析技術及其應用湖北科學技術出版社（1992 ） 28-302、 M.Z. 阿塔西 , C.J.范奧斯 , D.R. 阿勃索洛姆主編 鄭昌學 , 吳安然等譯 分子免疫學 科學出版社 (1988) 212-214第六節 免疫球蛋白 G 的親和層析純化法（蛋白A或蛋白 G法）基本原理蛋白 A 是金黃色葡萄球菌的細胞壁(cell wall)(cell wall) 成分。蛋白 G 是 G 組鏈球菌的細胞壁(cell wall)(cell wall) 成分。這兩種蛋白質分子可通過

29、免疫球蛋白的FC 區和大多數哺乳動物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的 IgG 結合 ( 見表 1) 。利用基因工程 (GeneticEngineering)(Genetic Engineering)技術，將蛋白 A 和蛋白 G 分子中與 Fc 區結合的結構域部分的基因融合， 所產生的融合蛋白，則具有更廣泛的 IgG 結合特異性。 蛋白 A、蛋白 G 或融合蛋白 A/G 與免疫球蛋白 Fc 段的結合性能使它成為可用于IgG 分離的、天然的親和配基。將這些配基蛋白結合到固體支持物上，提供了應用親和層析純化抗體的一步法的基礎。試劑及儀器l 含 IgG 的樣品

30、l PBS(見附錄 )l 裝有 2ml 固相化的蛋白A、蛋白 G 或蛋白 A/G 的小型層析柱( 有商品供應 )l 透析袋 (MWCO 10,000)-13精選文庫l 結合緩沖液： 0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 + 0.15mol/L NaCl l 分步收集器 (可按需要選用 )l 洗脫緩沖液 :0.1mol/L Gly-HCl pH2.8+0.15mol/L NaCll 中和緩沖液： 1mol/L Tris-HCl pH 8.0 l 蠕動泵 ( 可按需要選用 )l UV 監測器l pH 計操作步驟* 樣品 (可為血清、腹水、含有 IgG 的單克隆和多克隆抗體的細胞上清液)

31、。1 樣品在 4 ,對結合緩沖液透析過夜，或將其與至少1 ：1 稀釋的結合緩沖液混合；2 如果條件充許，將層析柱與蠕動泵、分步收集器和UV 監測器相連；3 至少用 10ml 結合緩沖液 , 以 1ml/min速度 , 洗滌柱中的2ml 親和層析介質；4 上樣；5 一旦樣品進入凝膠，用結合緩沖液洗柱（至少 10 個柱體積） ，直至 A280nm小于 0.03 ；6 用洗脫緩沖液洗脫所結合的IgG, 分布收集 2ml/ 管；7 收集過程中 , 每管立即加入0.1ml 中和緩沖液，以中和洗脫所得的IgG 液。8含 IgG 的各管對 PBS 透析 ,其后根據抗體的穩定性,加入防腐劑 (0.020g/L

32、疊氮鈉 ) ，置 4或冷凍保存。實驗要點及說明通常可通過 SDS-PAGE 分析或通過適當的免疫方法( 如 Western blot, ELISA等 ) ，對洗脫組分進行純度鑒定和免疫活性測定。1. 上樣量由層析柱的對特定免疫球蛋白的容量確定，2ml 柱對于小鼠 IgG的容量約 10mg ，對于人 IgG 的容量約為 18mg ；-14精選文庫2. 柱上結合的抗體被洗脫的速度很快, 通常在第一洗脫流份中；3. 下列緩沖液也可用為結合緩沖液：含0.15mol/L NaCl 的 50mmol/L 硼酸鈉 pH8.0, 或含0.15mol/L NaCl 的 0.1 mol/L 磷酸鹽液 pH7.5

33、。 高鹽結合緩沖液（ >1 mol/L NaCl ）可能增加總的柱結合容量約 50% ；4.應用 pH8.0-9.5 的緩沖液作為結合緩沖液，通常能增加蛋白A 對小鼠 IgG的結合力；5.對于蛋白 G 的層析柱，可用低 pH 的結合緩沖液 ,如 pH5.0 含 0.15 mol/L NaCl的 50mmol/L醋酸緩沖液；6.對 pH 敏感的抗體 ,需用比較溫和的洗脫液 , 如 : 含 0.2mol/LNaCl 的 0.1mol/LTris- 醋酸pH7.7 或 3mol/L KCl 或 5.0mol/L KI或 3.5mol/L MgCl2 ；7.蛋白 G 也能與 IgG 的 CH1

34、區結合 , 所以不能用于 F(ab )2與 Fc 的分離；8.如果無蠕動泵和部分收集器可用,也可利用重力進行上樣及洗脫,手動收集2ml / 管,用分光光度計測定280nm 的吸光度。參考文獻1. Bjorck,L, And Kronvall,G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG binding reagent. J. Immunol. 133,969-9742.（張文利、朱正美）第七節應用酶解從IgG 制備 F( ab )2的方法基本原理本文介紹應用胃蛋白酶及菠蘿蛋白

35、酶從IgG 制備 F( ab)2的方法。這兩種酶均在免疫球蛋白的絞鏈區雙硫鍵的下方分解IgG（見圖 1 ），裂解產物為三個片段，即兩個相同的Fab 段和一個 Fc 段， Fab 段即抗原結合片段，含有一條完整的輕鏈和半條重鏈，分子量約50000 。首選的酶是胃蛋白酶，它在IgG 的絞鏈區二硫鍵的近C 末端切斷重鏈，生成大、小兩個片段，大片段為Fab 雙體，稱為F( ab )，2其功能與Fab 相同。胃蛋白酶可用于大多數的小鼠的 IgG 及 IgG a 以及大鼠、人和兔的IgG 抗體制備 F( ab )2，但不能用于小鼠的IgG b抗體。應用本法，可通過HPLC 測定組分的大小來判定水解的程度。

36、F( ab ) 組2分在分子量100000 部分洗脫，而IgG 則在分子量150000 的流分中。由于小鼠IgG 抗體抗胃蛋白酶，或使酶水解為較小的肽段，因此可采用菠蘿蛋白酶，或經-15精選文庫過預試來選擇確定合適的蛋白酶。圖 2-7-1 IgG 不同蛋白酶水解部位示意圖試劑及儀器l 0.2mol/L TE8: 0.2mol/L Tris-HCl pH8.0 + 10mmol/L EDTA，按要求稀釋到20mmol/L TE8l 2mol/L醋酸 , pH3.7 ： 103ml 冰醋酸+ 17.2克醋酸鈉用蒸餾水配至1Ll 70mmol/L醋酸 / NaCl， pH4.0 ： 70m mol/

37、L ,50m mol/L ,pH4.0 (22ml冰醋酸 , 1.15 克醋酸鈉， 2.29 克 NaCl，用蒸餾水配至1Ll 胃蛋白酶： 10mg/ml胃蛋白酶溶于70m mol/L醋酸 / NaCl 液 pH4.0 ，現用現配l 1 mol/L Tris pH9.2 (121克 Tris 堿溶于1L 蒸餾水，以HCl 調至 pH9.2)l 50m mol/L TE7： 50m mol/L Tris-HCl pH7.0 + 2 mol/L EDTAl 2- 巰基乙醇l 碘乙酰胺儲存液：50 mmol / L碘乙酰胺液l 50m mol/L TE7 碘乙酰胺應用液：（加 1% 體積的碘乙酰胺儲

38、存液到 50m mol/L TE7 中，現用現配l 菠蘿蛋白酶： 10mg/ml 的 50m mol/L TE7 液，在臨水解前配制。加入 2- 巰基乙醇至終濃度為 0.5 mol/L ，在 37保溫 15 分鐘，以使酶活化l 10 ， 000 MWCO 濾膜的濃縮裝置l 分級范圍10000-250000的分子排阻層析HPLC 系統l 可分離 150000 蛋白質的凝膠過濾（分子排阻）柱。 可用兩根直徑 2.5cm 、凝膠床高 80cm 的柱子 * ，以 30ml/ 小時的流速，來分離 10-100mg 的 IgGl 水浴l 透析帶（ 10000 MWCO ）。用前在含0.1mmol/L ED

39、TA的蒸餾水中煮沸、清洗操作步驟（一）酶解 IgG 樣品的用量-16精選文庫通常酶解 50-200mg IgG ，可生成 20- 100mg F(ab)2。對于新抗體，可先用 5-15 mg 試做，以確定所用酶對抗體的水解能力；（二） IgG 的濃度及予處理將 IgG 濃縮到 10-15 mg/ml ，為進行胃蛋白酶水解， IgG 要先對 0.02 mol/L TE8 透析，為進行菠蘿蛋白酶水解， IgG 要先對 50mmol/LTE7 透析；（三）胃蛋白酶水解法1 用 2 mol/L 醋酸（pH 3.7 ）將抗體液的 pH 調到 4.0-4.2 ，將胃蛋白酶終濃度稀釋到 30g/L （W/W

40、 ） ;2 在 37 水浴中保溫酶解。每次取樣10 通l過 HPLC 測定水解組分的分子大小。在水解過程中， HPLC 測定的洗脫峰應從IgG 的單峰變成兩個峰，分子量小的組分是F(ab)2。水解通常需要6-12 小時；3 當水解到IgG 濃度 100g/L ， 或 F(ab 峰)2的大小不再增加時，加入 1 mol/L Tris（pH9.0 ），調節反應液到pH 8.0 ，以終止反應。（四）菠蘿蛋白酶水解法1 向抗體溶液中加入已活化的菠蘿蛋白酶液，達到需要的濃度。對不同抗體，所需的酶濃度要先用預實驗來確定，一般的酶濃度在5-40g/L (W/W)之間；2 反應過程中，同胃蛋白酶水解法一樣，用

41、HPLC 來監測水解的程度；3 當水解到 IgG 濃度 100g/L ，或 F(ab )峰的大小不再增加時， 加入碘乙酸至終濃度 0.5m mol/L ，終止反應。（五）產物F(ab) 2的分離1 用經過 0.2 mol/L TE8平衡的凝膠過濾柱，按分子量大小來分離水解組分;2 分離后，將分子量100000 的 F(ab )峰2合并、濃縮 .圖 2-7-2 產物 F(ab) 2與 IgG 的分離實驗要點及說明1 胃蛋白酶的活性對 pH 高度敏感，在最適 pH 范圍外， pH 下降其活性會明顯增加， pH 上升，其活性則會明顯下降；2大多數的IgG1 的水解需6-12 小時。也可將水解液置4

42、水解過夜。小鼠IgG3 很難被-17精選文庫酶解消化成F(ab) 2；3 當需要完全不含 IgG 或 Fc 段的 F(ab )時2，水解產物還需通過抗 - Fc 免疫吸附柱純化（請參閱參考文獻 1），或通過蛋白 A-瓊脂糖柱純化；4 水解的程度也可通過非還原性的. SDS-PAGE 與考馬氏藍染色來測定。參考文獻 Glennie, MJ., Tutt, AL. And Greenman, J. (1993) Preparation of multispecific F(ab)2and F(ab )3 antibody derivatives. In Tumor Immuology. A Pra

43、tical Approch (eds. Gallagher , G., Rees, RC. And Reynolds, CW.). pp.225-244. Oxoford University Press.2. Lamoyi, E. And Nisonoff, A. (1983) Preparation of F(ab )2 fragmentsFrom mouse IgG of various subclasses. J. Immunol. Meth. 56, 235-243.（朱正美）第八節從 F(ab)2制備 Fab基本原理在 F(ab)2絞鏈區的雙硫鍵可用巰基乙醇使之還原，得到具有游離S

44、H 基的 Fab，隨后可用碘乙酸使Fab 的游離 SH 基烷基化，從而防止其再氧化生成F(ab)2。試劑與設備l 0.2 mol/L TE8: 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 + 10m mol/L EDTAl 2-ME 還原溶液： 220mmol/L 2-巰基乙醇 mmol/L EDTA（在通風櫥中配置此溶液）l 250mmol/L碘乙酸 : 250mmol/L碘乙酸儲存液l HPLC 系統及凝膠過濾柱（同前）l 透析袋。經過在含0.1mmol/L EDTA水中煮沸及沖洗操作步驟1. F(ab的濃)2縮：將所得的F(ab 液)2濃縮到0.5-15mg/ml范圍；2. 還

45、原：-18精選文庫（1 ） 向 F(ab)2液中加入 1/10體積的 2- 巰基乙醇還原液（終濃度為20m mol/L 2-巰基乙醇）；（2） 在 25 水浴中保溫30 分鐘；（3 ） 加入 1/10 體積的250m mol/L 碘乙酸，以封閉游離的SH 基；（4） 在 25 水浴中保溫10 分鐘；（5 ） 用 HPLC 分析法， 通過比較 F(ab)2原液與還原生成的Fab的量， 來檢測還原度。 Fab在 F(ab)2之后被洗脫，使得洗脫的峰形改變（見圖1 ）。 Fab的分子量為 50000 ；（6 ） 在大多數的情況下，大于950g/L 的 F(ab)2被還原為 Fab。3. Fab 產物

46、的分離：（1 ） 如果在制備液中僅存在少量的未還原的F(ab)2，是符合實驗需要的，殘余的2- 巰基乙醇和碘乙酸可通過對緩沖液透析以除去；（2 ） 如果還原不夠充分，或需要Fab完全與未還原的 F(ab)2分離，則可在 0.2 mol/L TE8液中通過凝膠過濾法進行分離，合并、濃縮分子量為50000的 Fab峰。圖 2-7- 4 Fab 產物與 F(ab)2的分離（圖 240 ）實驗要點及說明1. 上述操作也會使 IgG 的部分重鏈雙硫鍵還原，但因非共價相互作用還可維持重鏈與輕鏈的連系，故不影響 Fab 段與重鏈的結合性能。 然而，在非還原性 SDS-PAGE 分析圖譜中，則可看到完整的 Fab（分子量大約 50000Da ）及輕鏈（大約 25000Da ）兩條條帶；2. 可用 100g/L 的非還原性SDS-PAGE，來檢測反應液中F(ab 的)2還原程度。 F(ab 條)2帶約分子量100000Da ，Fab在 50000 Da ，而已還原的重鏈及輕鏈分子量為25000 Da，條帶容易分辨。參考讀物Glennie,MJ., McBride,HW,.Worth,AT. AndStevenson,GT. (1987)Preparationandperforman