1、細胞篩選 一嘌呤霉素一確定最優篩選濃度 當用于篩選特定細胞的嘌呤霉素適宜濃度未知時，需進行滴定， 或制定針對那種細胞的嘌呤霉素殺菌曲線。 一般而言， 嘌呤霉素 濃度范圍在 2-10 微克 / 毫升時是足以殺滅大多數未轉染的哺乳 動物細胞系。 1. 培養待轉染而不是轉染后的細胞。 篩選的 目的是殺滅未轉染的細胞 2. 取對數生長期的細胞 一般在鋪滿 培養器皿底部的 70%80%時，用新鮮無抗無血清的培養基制成x 105個 /ml 的細胞懸液。3. 向 96 孔培養板中加細胞懸液，每孔 100 微升使每孔細胞數 在X 104個，然后向每孔加新鮮無抗無血 清的培養基適量，培養箱中靜置培養過夜。 這樣

2、做是為了保證 在固定細胞密度下確定最正確 G4 1 8藥物篩選濃度。 4. 第二天用嘌呤霉素濃度分別為0,2,4,6,8,10 微克/毫升的新鮮無抗無血清培養基溶液替換各孔中的舊的培 養基。每個濃度可用兩個復孔， 相當于每個濃度測定三次 。注 意：對于多數細胞種類而言， 過量的嘌呤霉素能引起許多非必需 的表型的反響。 5. 每日檢查細胞活力， 根據細胞活力， 每三天 即每隔兩天 更換 含嘌呤霉素的新鮮無抗無血清培養基溶液一 次。如細胞生長過快，可以縮短換液時間每隔一天 。6. 在正常的實驗操作規程時， 一種細胞最優篩選濃度確實立時間 隨細胞的生長率和一般生存時間而定，大概需 3 到 14 天。

3、在所需時間之后，嘌呤霉素的導致所有細胞死 亡的最小濃度就是應該用于該細胞和該實驗的濃度。 最優濃度為 在 3-5 天內殺死所有細胞的濃度。二轉染細胞1. 第一天：在60mm培養皿內種植細胞，細胞密度為能使第二天細胞融合能到達70%-80%勺密度，C02孵箱過夜培養。2. 第二天： 準備 3ml 無抗生素無血清培養基， 參加 Polybrene 使其終濃度為8卩g/ml。將已經制備的病毒顆粒ml加至上述培養基，輕吹混勻。去除60mm培養皿內的舊的培養基，參加含病毒培養基。 Polybrene 能夠增加病毒感染的效率， 然 而 ， 有 時 候 Polybrene 對 細 胞 有 毒 性 。 這 時

4、 ， 可 以 用 ProtamineSulfate 代替 Polybrene 三篩選細胞1. 病毒感染后 24 小時，可以換用含最優濃度 puromycin 的培養2. 如果病毒對細胞有毒性， 可以減少感染時間至 4-6 小時，然后 換用新鮮培養基， 24-48 小時后換加含最優濃度 puromycin 的培養基。最好設立一個對照皿，不加病毒液， 參加 Ploybrene ，觀察 Polybrene 是否對細胞有毒性；如果 Polybrene 沒有毒性，還可以參加 puromycin ，作為 puromycin 是否有效的對照。3. 以后每隔一天換用新鮮含 puromycin 的無抗生素無血清

5、培養 基，以替換含大量死細胞的培養基。直到抗性 群落能被識別出一般是在篩選后10 到 12 天。4. 待抗性細胞長滿以后，細胞轉入 10cm培養皿，同時，留一部 分細胞在原來的60mm平皿內。5.60mm平皿內細胞長滿后，收獲 細胞，在蛋白或 mRNA水平鑒定基因敲低效率。6.10cm 培養皿內的細胞待長滿后傳代，首先每種穩定細胞系凍 存 4-5 支細胞，待基因敲低鑒定清楚后，解凍凍存細胞，進行表型觀察分析。通常情況下，由于慢病毒為復制 缺陷型病毒， 受感染的細胞不能產生新的病毒， 因此從參加病毒 顆粒開始，經過 5-6 次換液后，培養基內已不存在病毒顆粒，可 以移至普通細胞培養室內培養研究。

6、二 G418一確定最優篩選濃度由于每種細胞對 G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最正確篩選濃度。1. G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸餾 水定容至10ml (使G418終濃度為ml,HEPES終濃度為100mmol/L),過濾消毒，4度保存。HEPES 的 化 學 全 稱 為 羥 乙 基 呱 嗪 乙 硫 磺 酸 ( N ' -a-hydroxythylpiperazine-N'-ethanesulfanicacid )，分子量，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間的控

7、制溶液的 pH 處于恒定的 范圍，而對細胞無毒性作用。1mol/LHEPES的簡單配置：HEPES23 83g，溶解于80ml的雙蒸 水中，用10mol/L的NaOH調節pH至wk_ad_begin(pid:21);wk_ad_after(21,function()$('.ad- hidden').hide();,function()$('.ad-hidden').show(););，定容至100ml，小濾器過濾。HEPES使用終濃度為10-50mmol/L。2. 制備篩選培養基：在 100ug/ml1000ug/ml范圍內按Oug/ml、 100ug/ml 、

8、200ug/ml 、300ug/ml 、400ug/ml ，500ug/ml 、 600ug/ml 、 700ug/ml 、 800ug/ml ， 900ug/ml 、 1000ug/ml 濃度用無抗無血清培養基稀釋G418制成篩選培養基。心得：由于特性明確的細胞系 G418的最正確用量還是比擬穩定的，所以有 時候不需要在這么大范圍內進行篩選。比方說你要轉染 NIH3T3 細胞，現在我告訴你我測試過 NIH3T3細胞對G418的敏感性，我 用 的 篩選濃度是 200ug/ml 。 這時你就可以做 150ug/ml 、 200ug/ml 、 300ug/ml 三個濃度進行篩選。 3. 培養待轉染

9、(而不 是轉染后)的細胞。 (篩選的目的是殺滅未轉染的細胞) 4. 取對 數生長期的細胞(一般在鋪滿培養器皿底部的70%80%時)，用新鮮無抗無血清的培養基制成1 x 104個/ml的細胞懸液。5. 向 96 孔培養板中加細胞懸液，每孔 100 微升使每孔細胞數在 1x 103 個，然后向每孔加新鮮無抗無血清 的培養基適量，培養箱中靜置培養。 這樣做是為了保證在固定 細胞密度下確定最正確 G4 1 8藥物篩選濃度。 集合度：實際上就是 指細胞占培養外表的比例， 如果細胞鋪滿了整個容器， 我們就認 為它們 1 00%集合，也就是集合度 100%。集合度對 G4 1 8篩選結果 的影響很大，一般篩

10、選時集合度不宜超過50%！6. 培養 6 小時左右開始加藥。加篩選培養基篩選 : 吸除培養孔中 培養基，PBS洗滌一次，每孔中參加不同濃度的篩選培養基適量。7. 換液：每日檢查細胞活力，根據細胞活力和培養基的顏色，每 三天 即每隔兩天 更換篩選培養基一次。如細胞生長過快，可以縮短換液時間每隔一天 。有死細胞勤 換液，可以減少對存活細胞的影響。8. 確定最正確篩選濃度： 在正常的實驗操作規程時， 一種細胞最優 篩選濃度確實立時間隨細胞的生長率和一般生存時間而定，在篩選 1014天內能夠殺死所有細胞的最小 G418濃度即為最正確篩選濃度。在第一輪就篩選出最正確G418濃度的可能性不大，最有可能的是

11、出現這種情況：用某一濃度 G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的G418的 量在 10 天前就看不到活細胞了。 假設是 400ug/ml 不能殺死細胞， 而 800ug/ml 在第 5 天就把所有細胞都殺死了，那么可以再用 500ug/ml 、600ug/ml 、 700ug/ml 進一步篩選，以確定最正確篩選 濃度。二轉染細胞1. 第一天：在60mm培養皿內種植細胞，細胞密度為能使第二天細胞融合能到達70%-80%勺密度，C02孵箱過夜培養。2. 第二天：準備 3ml 無抗生素無血清培養基，參加 Polybrene ，終濃度為8卩g/ml。將已經制備的病毒顆粒ml加至上述

12、培養基，輕吹混勻。去除60mm培養皿內的舊的培養基，參加含病毒培養基。 Polybrene 能夠增加病毒感染的效率， 然而， 有 時候 Polybrene 對細 胞 有 毒 性。 這 時， 可 以用 ProtamineSulfate 代替 Polybrene 3. 轉染后培養 24 小時或者 更長，到細胞增長接近 70集合時按 1： 4密度傳代， 繼續培養， 待細胞密度增至50%70%集合時開始篩選。三篩選細胞1. 加G418:去掉培養液，PBS洗一次，參加按最正確篩選濃度配制 好的G418篩選培養基無抗無血清實 際應用時可以比最正確篩選濃度高一級別 。2. 換液：根據培養基的顏色和細胞生長情

13、況， 每 35天更換一次 篩選培養基。當有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選 1014天后，可見有抗性的克隆 出現，停藥用完全培養基培養。3. 待其逐漸增大后，挑出單克隆：制備細胞懸液，細胞計數，用培養基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中參加培養基 150ul/ 孔，再參加細胞懸液 10ul/ 孔。待其逐漸增大 后轉入到 48 孔中增殖。 4. 單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取 總RNA做RT-PCR檢測目的基因是否存在。典型貼壁細胞平板 密度培養板大小生長面積cm2大約細胞數培養基容積ml組織培養皿© 60mm 286. 6 X 1055-66 孔培養板

14、69; 35mm 3X 1051 -212 孔培養板© 41. 3X 1050.5-124 孔培養板© 8mrj 0. 50. 6X 1050. 25-0 . 5慢病毒使用操作手冊一、慢病毒的儲存與稀釋 :1. 病毒的儲存： 收到病毒液后在很短時間內即使用慢病毒進行實驗，可以將病毒暫時放置于4 C保存；如需長期保存請放置于-80 C 病毒置于凍存管，并使用圭寸口膜圭寸口病毒可以存放 于-80 C 6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前需要重新滴定病毒滴度反復凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度 10%因 此在病毒使用過程中應僅盡量防止反復凍融，為防止反

15、復凍融 , 建議收到病毒后按照每次的使用量進行分裝。2. 病毒的稀釋： 如果需要稀釋病毒， 請將病毒取出置于冰浴融解 后，使用培養目的細胞用 PBS或無血清培養基含血清或含雙抗 不影響病毒感染?；靹蚍盅b后4C保存請盡量在三天內用完 分裝后使用。二、慢病毒用于體外 InVitro 實驗：感染培養原代細胞和建系細胞。 慢病毒對各種細胞和組織的親嗜 性不同， 在使用慢病毒之前可以通過查閱相關文獻， 了解慢病毒 對您的目的細胞的親嗜性，感染復數MOI值以及在體InVivo 注射所需要的病毒量。 如果沒有相關文獻支持， 可以通過感染預 實驗得到適宜的感染復數MOI值使用24孔板檢測病毒對目 的細胞的親嗜

16、性 。慢病毒感染目的細胞預實驗1. 慢病毒感染目的細胞預實驗考前須知： 測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時，需要同時設置對慢病毒親嗜性較高的細胞HEK293T Hela作為平行實驗的對照細胞。 在進行慢病毒感染實驗時， 可以用完全培養基 培養目的細胞 用稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養因子的完全培 養基不影響慢病毒的感染效率。 一般慢病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病 毒顆粒數。如：病毒滴度為 >1X108TU/ml 即每毫升病毒液中至少 含有 1X108 個具有生物活性的慢病毒顆粒。2. 以24孔培養板為例，進行目的細胞和 HEK293T細胞的感染預 實驗實驗前按

17、照不同的 MOI設置不同的感染孔，并根據MOI和細 胞數量計算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無 血清培養基稀釋病毒原液。第一天，準備細胞：在 24 孔培養板接種假設干孔，每個孔內接種35X104個目的細胞，鋪板時細胞的融合率為 50%左右，每孔培 養基體積為100卩| ;進行病毒感染時細胞的融合度約為 70%左 右。第二天，準備病毒：取出 4°C保存的病毒，使用臺式離心機離心 20秒(使病毒完全懸于離心管底部即可)；如果是凍存在-80 C 的病毒需要先在冰上融化后使用。 亦可以根據實驗室的實際情況 將按照MOI準確計算好的慢病毒稀釋到培養基中，并盡可能保證 所獲得的含

18、 wk_ad_begin(pid:21);wk_ad_after(21,function()$('.ad- hidden').hide();,function()$('.ad-hidden').show(););有慢病毒的培養基的總體積為最小體積， 以期獲得最正確的感染效 率。第二天，感染目的細胞： 病毒準備好之后， 從培養箱中拿出細胞， 首先察細胞生長狀態，如細胞狀態較好那么開始實驗。a 使用移液器吸取準確體積的病毒液參加準備好的培養基。 b吸去培養基的培養器皿中的培養基如果細胞生長良好，密度 適宜，那么不用換液。c在目的細胞和對照細胞中分別參加計算 好的病毒

19、液。d混勻后放于二氧化碳培養箱37 C、5%C0孵育過夜。注：感染前細胞的狀態好壞對最終的感染效果上下影響很大，所以務必保證加病毒之前細胞處于良好的生長狀態。亦可以將預先準備好的培養基和慢病毒的混合液直接參加培養器皿中。慢病毒對目的細胞的感染效率較低， 通過提高MOI值可以提高病毒的感 染效率，但是當 MOI高于20時，我們建議在培養基中參加 ploybrene 8卩g/ml左右來提高病毒的感染效率。第三天，更換培養液：一般在 24小時候后將含有慢病毒的培養 液更換成正常培養液；在感染后觀察細胞狀態，如果慢病毒對細 胞有明顯毒性作用而影響細胞生長狀態，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養液后繼續培養建議在8-12小時更換為宜。第一次換液后，如果