1、脂質體的制備及包封率的測定脂質體的制備及包封率的測定 沈陽藥科大學藥劑學教學實驗中心1聽風D學堂一、一、實驗目的實驗目的1、掌握薄膜分散法制備脂質體的工藝。2、掌握用陽離子交換樹脂測定脂質體包封率的方法。3、熟悉脂質體形成原理，作用特點。4、了解“主動載藥” 與“被動載藥” 的概念。 2聽風D學堂二、二、實驗原理實驗原理 脂質體是由磷脂與(或不與)附加劑為骨架膜材制成的，具有雙分子層結構的封閉囊狀體。 常見的磷脂分子結構中有兩條較長的疏水烴鏈和一個親水基團。將適量的磷脂加至水或緩沖溶液中，磷脂分子定向排列，其親水基團面向兩側的水相，疏水的烴鏈彼此相對締和為雙分子層，構成脂質體。3聽風D學堂 用

2、于制備脂質體的磷脂有天然磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂等；合成磷脂，如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿等。常用的附加劑為膽固醇。膽固醇也是兩親性物質，與磷脂混合使用，可制得穩定的脂質體，其作用是調節雙分子層的流動性，降低脂質體膜的通透性。其他附加劑有十八胺、磷脂酸等，這些附加劑能改變脂質體表面的電荷性質，從而改變脂質體的包封率、體內外穩定性、體內分布等其他相關參數。4聽風D學堂 脂質體的制備方法有多種，根據藥物的性質或研究需要來進行選擇。 (1)薄膜分散法 這是一種經典的制備方法，它可形成多室脂質體，經超聲處理后得到小單室脂質體。此法優點是操作簡便，脂質體結構典型，但包封率較低。 (2)

3、注入法 有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醇注入法”是將磷脂等膜材料溶于乙醇中，在攪拌下慢慢滴于55-65含藥或不含藥的水性介質中，蒸去乙醇，繼續攪拌12h，即可形成脂質體。 （3）逆相蒸發法 系將磷脂等脂溶性成分溶于有機溶劑，如氯仿、二氯甲烷中，再按一定比例與含藥的緩沖液混合、乳化，然后減壓蒸去有機溶劑即可形成脂質體。該法適合于水溶性藥物、大分子活性物質，如胰島素等的脂質體制備，可提高包封率。 其他方法：冷凍干燥法 、熔融法 等。 5聽風D學堂 在制備含藥脂質體時，根據藥物裝載的機理不同，可分為“主動載藥” 與“被動載藥”兩大類。所謂“主動載藥”，即通過脂質體內外水相的不同離子或化合物梯度進行

4、載藥，主要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。傳統上，人們采用最多的方法是“被動載藥”法。所謂“被動載藥”，即首先將藥物溶于水相或有機相(脂溶性藥物)中，然后按所選擇的脂質體制備方法制備含藥脂質體，其共同特點是：在裝載過程中脂質體的內外水相或雙分子層膜上的藥物濃度基本一致，決定其包封率的因素為藥物與磷脂膜的作用力、膜材的組成、脂質體的內水相體積、脂質體數目及藥脂比(藥物與磷脂膜材比)等。6聽風D學堂 對于脂溶性的、與磷脂膜親和力高的藥物，“被動載藥”法較為適用。而對于兩親性藥物，其油水分配系數受介質的pH值和離子強度的影響較大，包封條件的較小變化，就有可能使包封率有較大的變化，首選“

5、主動載藥” 方法。 下圖為“主動載藥”中pH梯度法載藥原理示意圖7聽風D學堂H+H+DDDH+DH+insideacidpHoudsideneutralpH8聽風D學堂9聽風D學堂 評價脂質體質量的指標有粒徑、粒徑分布和包封率等。其中脂質體的包封率是衡量脂質體內在質量的一個重要指標。常見的包封率測定方法有分子篩法、超速離心法、超濾法等。本文采用陽離子交換樹脂法測定包封率。“陽離子交換樹脂法”是利用離子交換作用，將荷正電的未包入脂質體中的藥物(即游離藥物)，如本實驗中的游離小檗堿，通過陽離子交換樹脂吸附除去，包封于脂質體中的藥物(如小檗堿)，由于脂質體荷負電荷，不能被陽離子交換樹脂吸附，從而達到

6、分離目的，用以測定包封率。示意圖見下圖。10聽風D學堂Na+ SO-3Na+ SO-3Na+ SO-3Na+ SO-3Ber +Ber +Ber +Ber +Ber 11聽風D學堂 三、三、 實驗內容實驗內容 （一）（一）實驗材料與設備實驗材料與設備 1.實驗材料：鹽酸小檗堿、注射用大豆卵磷脂、膽固醇、無水乙醇、95乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、NaHCO3、陽離子交換樹脂。 2.實驗設備與儀器：旋轉蒸發儀、燒瓶、恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、吸耳球、光學顯微鏡、玻璃棉、5ml注射器筒、08 m微孔濾、紫外分光光度儀、溶量瓶等。12聽風D學堂 （二）實驗部分（二）實驗部分1 1空白

7、脂質體的制備（用于測定柱分離度用）空白脂質體的制備（用于測定柱分離度用）【處方】 注射用大豆卵磷脂 0.9g 膽固醇 0.3g 無水乙醇 2-20m1 磷酸鹽緩沖液 適量 制成約30m1脂質體 13聽風D學堂 【制備】 （1）磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制 稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）0.37g與磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）2.0g,加蒸餾水適量，溶解并稀釋至1000ml（pH約為5.7）。 （2）稱取處方量磷脂、膽固醇于100ml（也可以是250ml、500ml或1000ml ）燒瓶中，加無水乙醇1-2ml（根據情況可以加10ml或20ml ），置于65-70水浴中，攪拌

8、使溶解，于旋轉蒸發儀上旋轉，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，減壓除乙醇，制備磷脂膜。 （3）另取PBS 30ml于小燒杯中，同置于65-70水浴中，保溫，待用。14聽風D學堂 （4）取預熱的PBS 30ml，加至含有磷脂膜的燒瓶中，65-70水浴中攪拌水化10-20min。取出脂質體液體于燒杯中，置于磁力攪拌器上，室溫下，攪拌30-60min，如果溶液體積減少，可補加水至30m1，混勻，即得。（整個過程也可在旋轉蒸發儀上完成，其它的脂質體制備也可在旋轉蒸發儀上完成。） （5）取樣，在油鏡下觀察脂質體形態，畫出所見脂質體結構，記錄最多和最大的脂質體的粒徑；隨后將所得脂質體溶液通過0.8m微孔濾膜兩遍，

9、進行整粒，再于油鏡下觀察脂質體的形態，畫出所見脂質體結構，記錄最多和最大的脂質體粒徑。15聽風D學堂 【注意事項】 (1)在整個實驗過程中禁止用火。 (2)磷脂和膽固醇的乙醇溶液應澄清，不能在水浴中放置過長時間。磷脂和膽固醇的比例可以采用4：1或5：1或6：1，如果磷脂和膽固醇的質量不好，建議采用6：1 。 (3)磷脂、膽固醇形成的薄膜應盡量薄。 (4)60-65水浴中攪拌水化10-20min時，一定要充分保證所有脂質水化，不得存在脂質塊。16聽風D學堂2 2鹽酸小檗堿脂質體的制備（被動載藥法）鹽酸小檗堿脂質體的制備（被動載藥法） 【處方】 注射用豆磷脂 0.6 g 膽固醇 0.2 g 無水乙

10、醇 2-20m1 鹽酸小檗堿溶液(1mgm1) 30ml 制成30ml脂質體17聽風D學堂 【制備】被動載藥法被動載藥法 (1)鹽酸小檗堿溶液的配制 稱取適量的鹽酸小檗堿溶液，用磷酸鹽緩沖液配成 lmgml和3mgm1兩種濃度的溶液。 (2)鹽酸小檗堿脂質體的制備 按處方量稱取豆磷脂、膽固醇置于100ml燒瓶中，加無水乙醇，余下操作除將PBS換成鹽酸小檗堿溶液外，同“空白脂質體制備”，即得“被動載藥法 ”制備的小檗堿脂質體。 【質量檢查】觀察粒子形態，最大粒徑與最多粒徑，藥物的包封率。 【注意事項】同前。18聽風D學堂3 3鹽酸小檗堿脂質體的制備（主動載藥法）鹽酸小檗堿脂質體的制備（主動載藥法

11、） 【空白脂質體處方】 注射用豆磷脂 0.9 g 膽固醇 0.3 g 無水乙醇 2-20 m1 檸檬酸緩沖液 30 ml 制成約30ml脂質體19聽風D學堂 【制備】主動載藥法主動載藥法 （1）空白脂質體制備 稱取磷脂0.9g和膽固醇0.3g，加入無水乙醇，置于65-70水浴中，攪拌使溶解，于旋轉蒸發儀上旋轉，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，減壓除乙醇。加入同溫的檸檬酸緩沖液30ml，6570水浴中水化10-20min ，取出脂質體于燒杯中，余下操作同“1 1空白脂質體的制備空白脂質體的制備” 。 20聽風D學堂 （2）主動載藥 準確量取空白脂質體2.0ml、藥液(3mgm1) 1.0m1、NaHC

12、O3溶液0.5m1，在振搖下依次加入10ml西林瓶中，混勻，蓋上塞，70水浴中保溫20min（定時搖動），隨后立即用冷水降溫，即得。 【注意事項】 (1) “主動載藥”過程中，加藥順序一定不能顛倒，加三種液體時，隨加隨搖，確保混合均勻，保證體系中各部位的梯度一致。 (2)水浴保溫時，應注意隨時輕搖，只需保證體系均勻即可，無需劇烈振搖。 (3)用冷水冷卻過程中，應輕搖。 【質量檢查】觀察粒子形態，最大粒徑與最多粒徑，藥物的包封率。 21聽風D學堂 【附注】 （1）檸檬酸緩沖液 稱取檸檬酸10.5g和檸檬酸鈉7g置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至1000ml，混勻，即得。 （2）NaHCO3

13、溶液 稱取NaHCO3 50g，置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至1000m1，混勻，即得。22聽風D學堂4 4鹽酸小檗堿脂質體包封率的測定鹽酸小檗堿脂質體包封率的測定 （1）陽離子交換樹脂分離柱的制備 取已處理好的陽離子交換樹脂適量，裝于底部已墊有少量玻璃棉（或多孔墊片）的5ml注射器筒中（總量約4ml刻度處），加入PBS水化過的陽離子交換樹脂，自然滴盡PBS，即得。 （2）柱分離度的考察 鹽酸小檗堿與空白脂質體混合液的制備：精密量取3mgm1鹽酸小檗堿溶液0.1ml，置小試管中，加入0.2ml空白脂質體，混勻，即得。23聽風D學堂 對照品溶液的制備：取中制得的混合液0.1ml置10m

14、l量瓶中，加入95乙醇6ml，振搖使之溶解，再加PBS至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續濾液4.0ml于10ml量瓶中，加PBS至刻度，搖勻，即得。 樣品溶液的制備：取中制得的混合液0.1m1至分離柱頂部，待柱頂部的液體消失后，放置5min，仔細加入PBS(注意不能將柱頂部離子交換樹脂沖散)，進行洗脫(約需2-3ml PBS)，同時收集洗脫液于10m1量瓶中，加入95乙醇6ml，振搖使之溶解，再加PBS至刻度，搖勻，過濾，棄取初濾液，取續濾液為樣品溶液。 空白溶劑的配制：取乙醇(95) 30ml，置50m1量瓶中，加PBS至刻度，搖勻，即得。24聽風D學堂 吸收度的測定：以空白溶劑為對照，在

15、345nm波長處分別測定樣品溶液與對照品溶液的吸收度，計算柱分離度。分離度要求大于0.95。 柱分離度 = 1A樣/（A對2.5） 式中，A樣樣品溶液的吸收度；A對對照品溶液的吸收度；2.5對照品溶液的稀釋倍數。25聽風D學堂 注意：在進行柱分離度實驗前，需要用空白脂質體對分離小柱進行飽和，具體操作如下：量取0.2ml空白脂質體，置于分離小柱頂部，待柱頂部的液體消失后，仔細用5mlPBS進行洗脫，待液體滴盡即可。26聽風D學堂 （3）包封率的測定 精密量取鹽酸小檗堿脂質體0.lml兩份，一份置10ml量瓶中，按柱分離度考察項下進行操作，另一份置于分離柱頂部，按 “柱分離度考察”項下進行操作，所得溶液于345nm波長處測定吸收度，按下式計算包封率。 包封率()=（ Al /At ）100 式中，Al通過分離柱后收集脂質體中鹽酸小檗堿的吸收度；At鹽酸小檗堿脂質體中總的藥物吸收度， At = A樣2.5 ，2.5為稀釋倍數。27聽風D學堂脂質體檢測結果 脂質