1、薄層色譜分析步驟及注意事項薄層色譜法(thin layer chromatography簡寫tlc)是一種物理化學的分離技術，常 用于藥物的分離與分析。現對此方法的分析步驟及注意事項提點建議。完成tlc分析通常需經制板、點樣、展開、檢出4步操作。制板在一平面支持物(通常為玻璃)上，均勻地涂制硅膠、氧化鋁或其他吸附劑薄 層、樣品的分離、檢測就在此薄層色譜板上進行。一般選用適當規格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄層板規格有： 10cmx20cm> 5cmx20cm> 20cmx20cm 等。稱取適量硅膠，加入 0.2%0.5%竣 甲基纖維素鈉溶液(cmc-na),充分攪拌均勻，進行制板

2、。一般來說10cmx20cm 的玻璃板，35g硅膠/塊；硅膠與竣甲基纖維素鈉的比例一般為1： 21： 4。 制好的玻璃板放于水平臺上，注意防塵。在空氣中自然干燥后，置110°c烘箱中 烘0.5lh,取出，放涼，并將其放于紫外光燈(254nm)下檢視，薄層板應無花斑、 水印，方可備用。點樣用微量進樣器進行點樣。點樣前，先用鉛筆在層析上距末端lcm處輕輕畫 一橫線，然后用毛細管吸取樣液在橫線上輕輕點樣，如果要重新點樣，一定要等 前一次點樣殘余的溶劑揮發后再點樣，以免點樣斑點過大。一般斑點直徑大于 2mm,不宜超過5mm.底線距基線12. 5cm,點間距離為lcm左右，樣點與玻 璃邊緣距離

3、至少lcm,為防止邊緣效應，可將薄層板兩邊刮去12cm,再進行 點樣。展開將點了樣的薄層板放在盛在有展開劑的展開槽屮，由于毛細管作用，展開溶 劑在薄層板上緩慢前進，前進至一定距離后，取岀薄層板，樣品組分因移動速度 不同而彼此分離。 展開室應預飽和。為達到飽和效果，可在室中加入足夠量的展開劑；或者在 壁上貼兩條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑屮，密封室頂的蓋。 展開劑一般為兩種以上互溶的有機溶劑，并且臨用時新配為宜。 薄層板點樣后，應待溶劑揮發完，再放人展開室中展開。 展開應密閉，展距一般為815cm。薄層板放入展開室時，展開劑不能沒過 樣點。一般情況下，展開劑浸入薄層下端的高度不宜超過0

4、.5cim 展開劑每次展開后，都需要更換，不能重復使用。 展開后的薄層板用適當的方法，使溶劑揮發完全，然后進行檢視。 rf值一般控制在0.30.8,當rf值很大或很小時，應適當改變流動相的比例。斑點的檢出展開后的薄層板經過干燥后，常用紫外光燈照射或用顯色劑顯色檢出斑點。 對于無色組分，在用顯色劑時，顯色劑噴灑要均勻，量要適度。紫外光燈的功率 越大，暗室越暗，檢出效果就越好。展開分離后，化合物在薄層板上的位置用比移值(rf值)來表示。化合物斑點 中心至原點的距離與溶劑前沿至原點的距離的比值就是該化合物的rf值。(-)有機合成中展開劑的選擇做有機合成時走板子是常有的事，展開劑的選擇就至關重要了。選

5、擇適當的 展開劑是首要任務。一般常用溶劑按照極性從小到人的順序排列大概為：石油醯 v己烷v苯乙kthf乙酸乙酯丙酮乙醇v甲醇。使用單一溶劑，往往不能達 到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的 混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用，展開劑的比例要靠嘗試。一般 根據文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑， 然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。展開劑的選擇條件：對所需成分有良好的溶解性；可使成分間分開； 待測組分的rf在0.20.8之間，定量測定在0.30.5之間；不與待測組分或吸 附劑發生化學反應；沸點適中，黏度較小；展

6、開后組分斑點圓且集中；混 合溶劑最好用新鮮配制。一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據需要加入 甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調節溶劑系統的極性，以達到好的分離效果，適合于生 物堿、黃酮、惦類等的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等 來調節，適合于蔥釀、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和祜類的分離；強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適 合于極性很大的生物堿類化合物的分離。很多時候，展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。我們在實驗中，為了實現一個配體與其他雜質有效分離，曾經嘗試了很多種的溶 劑組合，最

7、后才找到石油g-etoac-hcooh （5.5： 3.5： 0.1）混合溶劑。一般把 兩種溶劑混合時，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開的跡 象，再調整比例（或者加入第三種溶劑），達到最佳效果；如果沒有分開的跡象（斑 點較“拖最好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質上易分解的物質，在展 開劑里往往加一點點三乙胺，氨水，毗噪等堿性物質來中和硅膠的酸性。（選擇 所添加的堿性物質，還必須考慮容易從產品中除去，氨水無疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質量很有關系：不同廠家生產的硅膠可 能含水量以及顆粒的粗細程度，酸性強弱不同，從而導致產品在某個廠家的硅膠 中分離效

8、果很好，但在另一個廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質含量對分離效 果都有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實騎中我們發現有 時同一展開條件，上下午的r截然不同。展開劑的選擇主要根據樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來考慮， 在進行薄層層析時，首先應該知道未知化學成分的類型，其極性的大致歸屬，從 提取液或從色譜柱的流動相極性可知，另外某樣品里含多種化學成分先按極性不 同大致分，然后細分，對于分離未知的化學物質，展開劑的選擇也是一個摸索的 過程，不應該僅僅從展開劑考慮，多因素綜合衡量！溶劑：層析過程屮溶劑的選 擇，對組分分離關系極大。在柱層析吋所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習慣上

9、稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據被分離物質 與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當 被分離物質為弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質為強極性 成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑 （如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。在柱層操作 時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。 溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大 溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附 在層析柱上的各個成分逐

10、個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲 得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常'數&）來表示。介 電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化 鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中 所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。被分離物質的性質被分離的物質與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個要素，彼此緊密 相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離 物質的結構與性質有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。當然， 中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團的數f

11、t愈多，被吸附的住能就 會更大些，在同系物中碳原子數目少些，被吸附也會強些。總z,只要兩個成分 在結構上存在差別，就有可能分離，關鍵在于條件的選擇。要根據被分離物質的 性質，吸附劑的吸附強度，與溶劑的性質這三者的相互關系來考慮。首先要考慮 被分離物質的極性。如被分離物質極性很小為不含氧的祜烯，或雖含氧但菲極性 基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油儲或苯進行洗脫。 但多數中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般iiiiv 級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷 被分離物在某種溶劑系統中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，述與選擇

12、 的溶劑梯度有很大關系。現以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之 間的關系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷坯、烯坯、舀醇酯類、甘油 三酸醋和脂肪酸等組份。如對于c-27 體皂貳元類成分，能因其分字中梵基數 目的多少而獲得分離：將混合皂貳元溶于含有5%氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸 附柱上，采用以下的溶劑進行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化 鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5% 氯仿的苯，即可將一元拜基皂貳元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的 中草藥成分在不同的吸附劑中層析吋，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效 果，從而說明吸附劑、溶

13、劑和欲分離成分三者的相互關系。（-）簿層層析：薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱 層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進行層析時一即稱薄層層 析。其原理與柱層析基本相似。1 薄層層析的特點：薄層層析在應用與操作方面的特點與柱層析的比較。2. 吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區別 在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細，一般應小于250目，并要求粒 度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過高，以iiiii級為宜。 而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開距離相應縮短，一般 不超過10厘米，否則可引起色譜擴散影響分

14、離效果。3. 展開劑的選擇：薄層層析，當吸附劑活度為一定值時（如ii或iii級），對多組 分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性 成分中，大致可按其極性不同而分為無極性、弱極性、中極性與強極性。但在實 際工作屮，經常需要利用溶劑的極性大小，對展開劑的極性予以調整。展開劑的選擇：一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油醯v己烷v苯v乙醯 v乙酸乙酯v丙酮v乙醇v甲醇。使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果， 往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的 溶劑還有増加區分度的作用，常用的溶劑組合有：<p>petrol

15、eumether/ethylacetate,petroleumether/acetone,petroleumether/ether,petroleumether/ch2cl2, ethylacetate/meoh.chch/ethylacetate展開劑的比例要靠嘗試.一般根據文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開 劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好 的展開劑。展開劑的選擇條件：對所需成分有良好的溶解性;可使成分間分 開;待測組分的rf在0.20.8之間，定量測定在0.30.5之間;不與待測組 分或吸附劑發生化學反應;沸點適中，黏度較小;展開后組分斑點圓且集中

16、; 混合溶劑最好用新鮮配制。一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由止己烷和水組成，再根據需耍加入 甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調節溶劑系統的極性，以達到好的分離效果，適合于生 物堿、黃酮、帖類等的分離;中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由 甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于蔥釀、香豆素，以及一些極性較大的木 脂素和祜類的分離;強極性溶劑，由止丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙 酯等來調節，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。很多時候，展開劑的選 擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。一般把兩種溶劑混合時，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果 有分開的跡象，再調整比例

17、（或者加入第三種溶劑），達到最佳效果;如果沒有分開的 跡象（斑點較“拖”），最好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質上易分解的物質， 在展開劑里往往加一點點三乙胺，氨水，毗噪等堿性物質來中和硅膠的酸性。（選 擇所添加的堿性物質，還必須考慮容易從產品中除去，氨水無疑是較好的選擇。） 分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質量很有關系：不同廠家生產的硅膠可能含 水量以及顆粒的粗細程度，酸性強弱不同，從而導致產品在某個廠家的硅膠中分 離效果很好，但在另一個廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質盒量對分離效果都 有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實驗中我們發現有時同 一展開條件，上下午的rf截然不同

18、展開劑的選擇主耍根據樣品的極性、溶解度 和吸附劑的活性等因素來考慮在進行薄層層析時，首先應該知道未知化學成分的 類型,其極性的大致歸屬，從提取液或從色遷柱的流動相極性可知，另外某樣品 里含多種化學成分先按極性不同大致分，然后細分，對于分離未知的化學物質， 展開劑的選擇也是一個摸索的過程，不應該僅僅從展開劑考慮，多因素綜合衡量!洗脫劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關系極大。在柱層析時所用的溶劑（單 一劑或混合溶劑）習慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的 選擇，須根據被分離物質與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮在用極 性吸附劑進行層析時，當被分離物質為弱極性物質，一般選

19、用弱極性溶劑為洗脫 劑;被分離物質為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物 質用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須 相應降低。在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣 品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸 附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯 度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太 大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數（£） 來表示。介電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適

20、用于極性吸附劑，如 硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親 水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。顯色劑的配制：顯色劑可以分成兩大類：一類是檢查一般有機化合物的通用顯色劑;另一類 是根據化合物分類或特殊官能團設計的專屬性顯色劑。顯色劑種類繁多，本章只 能列舉一些常用的顯色劑。i.通用顯色劑 硫酸常用的有四種溶液：硫酸水（仁1）溶液;硫酸甲醇或乙醇（仁1）溶 液;1.5mol/l硫酸溶液與0.5-1.5mol/l硫酸鞍溶液，噴后110°c烤15min,不同 有機化合物顯不同顏色。 0.5%碘的氯仿溶液對很多化合物顯黃棕色。 中性0.05%高鎰

21、酸鉀溶液易還原性化合物在淡紅背景上顯黃色。 堿性高鎰酸鉀試劑還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色。溶液i： 1%高猛酸鉀溶液;溶液ii： 5%碳酸鈉溶液;溶液i和溶液i【等量混合 應用。 酸性高鐳酸鉀試劑噴1.6%高鐳酸鉀濃硫酸溶液（溶解時注意防止爆炸）， 噴后薄層于180°c加熱1520mino 酸性重銘酸鉀試劑 噴5%重銘酸鉀濃硫酸溶液，必要時150°c烤薄層。 5%磷鉗酸乙醇溶液噴后120°c烘烤，述原性化合物顯藍色，再用氨氣 薰，則背景變為無色。 鐵氟化鉀三氯化鐵試劑 還原性物質顯藍色，再噴2mol/l鹽酸溶液，則 藍色加深。溶液i： 1%鐵孰化鉀溶液;溶液i

22、i: 2%三氯化鐵溶液;臨用前將溶液i和溶液 ii等量混合。2 專屬性顯色劑由于化合物種類繁多，因此專屬性顯色劑也是很多的，現將在各類化合物中 最常用的顯色劑列舉如下：(1) 炷類 硝酸銀/過氧化氫檢出物：鹵代桂類。溶液：硝酸銀o.lg溶于水lml,加2苯氧基乙醇100ml,用丙酮稀釋至200ml, 再加30%過氧化氫1滴。方法：噴后置未過濾的紫外光下照射；結果：斑點呈暗黑色。 熒光素臭檢岀物：不飽和燒。溶液：i熒光素0.1g溶于乙醇100ml; 11.5%澳的四氯化碳溶液。方法：先噴(i),然后置含澳蒸氣容器內，熒光素轉變為四澳熒光素(曙紅)， 熒光消失，不飽和坯斑點由于漠的加成，阻止生成曙

23、紅而保留熒光，多數不飽和 坯在粉紅色背景上呈黃色。 四氯鄰苯二甲酸酹檢出物：芳香姪。溶液：2%四氯鄰苯二甲酸酢的丙酮與氯代苯(10： 1)的溶液。方法：噴后置紫外光下觀察。 甲醛僦酸檢出物：多環芳炷。溶液：37%甲醛溶液0.2ml溶于濃硫酸loml(2) 醇類 3, 5二硝基苯酰氯檢出物：醇類。溶液：1.2%本品甲苯溶液;ii .0.5%氫氧化鈉溶液;iti.0.002%羅丹明溶液。方法：先噴，在空氣中干燥過夜,用蒸氣薰2min,將紙或薄層通過試液 (ii)30s,噴水洗，趁濕通過(111)15s,空氣干燥，紫外燈下觀察。 硝酸肺鞍檢出物：醇類。溶液：1.1%硝酸鐘錢的0.2mol/l硝酸溶液

24、;ii.n,n-二甲基對苯二胺鹽酸鹽 1.5g溶于甲醇、水與乙酸(128ml+25ml+1.5ml)合液中，用前將與(ii)等量混 合。噴板后于105°c加熱5mino 香草醛/硫酸檢出物：高級醇、酚、笛類及精油。溶液：香草醛溶于硫酸looml方法：噴后于120°c加熱至呈色最深。 二苯基苦基偕月井檢出物：醇類、菇烯、撥基、酯與讎類。溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。方法：噴后于110°c加熱5lomirio結果：紫色背景呈黃色斑點。(3) 醛酮類 品紅/亞硫酸檢出物：醛基化合物。溶液:1.0.01%品紅溶液，通入二氧化硫直至無色;ii.0.05mol/l氯化丞溶液;i11.0.05mol/l 硫酸溶液。方法：將i、ii、iii以仁1： 10混合，用水稀釋至looml 鄰聯茴香胺檢岀物：醛類、酮類。溶液：本品乙酸飽和溶液。 2, 4-二硝基苯臍檢出物：醛基、酮基及酮糖。溶液:1.0.4%本品的2mol/l鹽酸溶液；ii .本品0.1g溶于乙醇100ml中，加 濃鹽酸iml方法：噴溶液i或ii后，立即噴鐵鼠化鉀的2