1、2010年分子生物學碩士生復習題1.闡述基因概念和你對基因定義的了解。從遺傳學的角度看，基因是生物的遺傳物質，是遺傳的基本單位突變單位、重組單位和功能單位；從分子生物學的角度看，基因是負載特定遺傳信息的DNA分子片段，在一定條件下能夠表達這種遺傳信息，變成特定的生理功能。有的生物基因為RNA。20世紀，基因的概念隨著遺傳學的發(fā)展而不斷地變換形式，擴大內涵。1）孟德爾“遺傳因子”孟德爾指出，生物每一個性狀都是通過遺傳因子來傳遞的，遺傳因子是一些獨立的遺傳單位。這樣把可觀察的遺傳性狀和控制它的內在的遺傳因子區(qū)分開來了，遺傳因子作為基因的雛形名詞誕生了。2）基因位于染色體上的遺傳功能單位1909年丹

2、麥遺傳學家約翰遜在提出“基因”概念，以此來替代孟德爾假定的“遺傳因子”。摩爾根首次完成了當時最新的基因概念的描述，即基因以直線形式排列，它決定著一個特定的性狀，而且能發(fā)生突變并隨著染色體同源節(jié)段的互換而交換，它不僅是決定性狀的功能單位，而且是一個突變單位和交換單位。3）順反子一個基因一條多肽1957年法國遺傳學家本滋爾以T4噬菌體作為研究材料分析了基因內部的精細結構，提出了順反子學說。這個學說打破了過去關于基因是突變、重組、決定遺傳性狀的“三位一體”概念及基因是最小的不可分割的遺傳單位的觀點，從而認為基因為DNA分子上一段核苷酸順序，負責著遺傳信息傳遞，一個基因內部仍可劃分若干個起作用的小單位

3、，即可區(qū)分成順反子、突變子和重組子。一個作用子通常決定一種多肽鏈合成，一個基因包含一個或幾個作用子。突變子指基因內突變的最小單位，而重組子為最小的重組合單位，只包含一對核苷酸。4）操縱子遺傳信息傳遞和表達調控的統(tǒng)一體 1961年法國雅各布和莫諾提出大腸桿菌乳糖操縱子模型，又大大擴大了人們關于基因功能的視野。他們發(fā)現了有些基因不起合成蛋白質模板作用，只起調節(jié)或操縱作用。從此根據基因功能把基因分為結構基因、調節(jié)基因和操縱基因。5）內含子和外顯子基因的結構是斷裂的（斷裂基因）人們在研究小雞卵清蛋白基因時發(fā)現其轉錄形成的mRNA只有該基因長度的1/4，其原因是基因中一些間隔序列的轉錄物在RNA成熟過程

4、中被切除了。這些間隔序列叫內含子，基因中另一些被轉錄形成RNA的序列叫外顯子。小雞的卵清蛋白基因中至少含7個內含子。因而從基因轉錄效果看，基因由外顯子和內含子構成。6）重疊基因1977年桑格（F. Sanger）領導的研究小組，根據大量研究事實繪制了共含有5375個核苷酸的X174噬菌體DNA堿基順序圖，第一次揭示了遺傳的一種經濟而巧妙的編排B和E基因核苷酸順序分別與A和D基因的核苷酸順序的一部分互相重疊。當然它們各有一套讀碼結構，且基因末端密碼也有重疊現象。7）可動基因或轉座元件基因并不全是固定在染色體的一個位置上早在20世紀40年代美國遺傳學家麥克林托克（B.McClintock）在玉米研

5、究中發(fā)現“轉座因子”，直至1980年夏皮羅（J.Shapiro）等人證實了可移位的遺傳基因存在，說明某些基因具有游動性。為此，這位“玉米夫人”榮獲了1983年度諾貝爾獎。8）染色體外基因這類基因存在于染色體外，它們的傳遞不符合孟德爾的分離和自由組合定律。如線粒體基因、葉綠體基因等。它們的基因編碼細胞其專一的蛋白質并自我復制。2.舉例解釋蛋白質二級結構、超二級結構（MOTIF）、三級結構、DOMAIN和四級結構。蛋白質二級結構: 一條多肽鏈主鏈院子局部的空間排列。蛋白質主鏈的折疊產生由氫鍵維系的有規(guī)則的構象。-螺旋：肽鏈的某段局部盤曲成螺旋形結構。-螺旋的特征是：般為右手螺旋；每螺旋包含3.6個

6、氨基酸殘基，每個殘基跨距為0.15nm，螺旋上升1圈的距離(螺距)為3.6×0.15=0.54nm；螺旋之間通過肽鍵上的>CO和-NH-間形成氫鍵以保持螺旋結構的穩(wěn)定；影響-螺旋形成的主要因素是氨基酸側鏈的大小、形狀及所帶電荷等性質。超二級結構：在蛋白質分子中特別是在球狀蛋白質分子中經?？梢钥吹接扇舾上噜彽亩壗Y構元件組合在一起，彼此相互作用，形成種類不多的、有規(guī)則的二級結構組合，在多種蛋白質中充當三級結構的構件，稱為超二級結構。3種基本組合形式：，和。常是由2股平行或反向平行的右手螺旋相互纏繞而成的左手卷曲螺旋。Domain結構域：多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級

7、結構的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體，稱為結構域。最普遍的結構是 / 型結構，它含有一個由-螺旋包圍著的平行或混合-回折的核。所有的糖酵解酶都是 / 型結構，許多其他的酶以及結合運輸蛋白也是這種結構。在 / 型結構中，由環(huán)區(qū)域形成結合裂縫，這些區(qū)域雖對結構的穩(wěn)定無作用，但通常參與結合和催化活性。MOTIF: 就是在許多轉錄因子的序列中,存在的負責與DNA結合的共同基序.這些基序通常都很短,僅含一小部分蛋白質結構,還通過與轉錄復合體的蛋白質之間的相互作用激活轉錄.如鋅指基序,亮氨酸拉鏈等都是MOTIF。三級結構：一條肽鏈的所有原子的空間排列。三級結構是在二級結構的基礎上由疏水作用和側鏈相

8、互作用形成的。如肌紅蛋白的三級結構有8段-螺旋區(qū)每個-螺旋區(qū)含724個氨基酸殘基，有18個螺旋間區(qū)肽鏈拐角處為非螺旋區(qū)（亦稱螺旋間區(qū)），包括N端有2個氨基酸殘基，C端有5個氨基酸殘基的非螺旋區(qū)內部存在一口袋形空穴，血紅素居于此空穴中。四級結構：幾個亞基在三級結構的基礎上相互作用所形成的空間結構。如紅細胞內的血紅蛋白是由4個亞基聚合而成的，4個亞基兩兩相同，即含兩個亞基和兩個亞基。在一定條件下，這種蛋白質分子可以解聚成單個亞基，亞基在聚合或解聚時對某些蛋白質具有調節(jié)活性的作用。3. 解釋大腸桿菌DNA復制的基本過程。根據反應階段和所需的不同酶類，DNA的復制可被分為三個階段，即復制起始、延伸和終

9、止。每個DNA復制的獨立單元被稱為復制子（replicon），主要包括復制起始位點（Origine of replication）和終止位點（terminus）。原核生物的整個染色體上一般只有一個復制起始位點。大腸桿菌DNA的復制需要有20種左右的酶和蛋白質因子參與，整個DNA復制機器被稱之為DNA replicase system或replisome。Helicase，任何DNA在被復制前都必須解開雙鏈，這個過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過程中所產生的扭曲力。DNA結合蛋白，使新解鏈的D

10、NA保持穩(wěn)定結構。Primases，為DNA復制提供RNA引物。DNA polymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。DNA Ligases，使新生DNA鏈上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯鍵。1. DNA復制的起始大腸桿菌中的復制起始位點是Ori C，全長245Bp，該序列在所有細菌復制起始位點中都是保守的。DNA復制起始中的主要步驟a. 大約20個左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個9堿基重復區(qū)相結合；b. 識別并使3個13堿基串聯重復區(qū)DNA形成開環(huán)結構；c. DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結合。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條D

11、NA母鏈結合，可在不同方向同時起始DNA的復制。當細胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時，DnaB的解鏈效率非常高。整個DNA復制過程中，只有復制起始受細胞周期的嚴格調控。"Once in each cell cycle。"DNA甲基化與DNA復制起始密切相關。OriC中有11個GATC回文結構（一般說來，256bp才應有一個GATC重復）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時，oriC與細胞原生質膜相結合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結合，起始新一輪的DNA復制。復制起始可

12、能還受ATP水解過程調控，因為DnaA只有與ATP相結合時才能與oriC區(qū)DNA相結合。2. DNA子鏈的延伸主要包括兩個不同但相互有聯系的事件，即前導鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結合使DNA單鏈穩(wěn)定。前導鏈的合成：由DnaG（primase）在復制起始位點附近合成一個10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。 滯后鏈的合成：產生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個片段相連。3. DNA鏈的終止當子鏈延伸達到t

13、erminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主要是由Ter-Tus復合物（ter utilization substance）來完成的。4.DNA聚合酶III各亞基的功能。DNA pol 是是多亞基組成的蛋白質,是合成DNA新鏈的主要復制酶，它在細胞中含量很少,但是催化效率高，異二聚體，全酶由、 10個亞基組成。其核心酶含有，和三個亞基。 亞基具有5'3'方向合成DNA的催化活性，每秒可以合成8個核苷酸 亞基具有3'5'外切酶的功能，起到校正的作用，

14、可提高聚合酶復制DNA的保真性。亞基常與亞基形成一個緊密的1:l復合物,協同發(fā)揮功能。 亞基使核心酶相互連接，組裝核心酶的功能。 亞基：促使核心酶二聚化，與模板連接，具有ATP酶活性。 亞基的功能猶如夾子，兩個亞基夾住DNA分子并可向前滑動，使聚合酶在完成復制前不再脫離DNA，從而提高了酶的持續(xù)合成能力。，和亞基組成復合體，其功能是幫助亞基夾住DNA，故稱為夾子裝置器。二聚體自己并不能組裝到DNA 上 ,它是通過復合物與ATP協同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上的。5.闡明Rolling Circle Replication。滾環(huán)式復制(rolling circle replication

15、)是一種復制方式，復制叉沿環(huán)形模板復制一定次數，每個反應中新合成的鏈將前一反應中合成的鏈拋出，形成與環(huán)狀模板鏈互補的一系列線性序列。這個過程。這個過程存在于某些噬菌體的營養(yǎng)復制過程和結合質粒的轉移復制過程。滾環(huán)復制復制過程包括：（1）一個由噬菌體基因組編碼的蛋白質A蛋白，在雙鏈DNA正鏈的特定位點即復制原點產生缺口。（2）切除原點后，A蛋白質仍與它產生的5端連接，3端在DNA聚合酶的作用下延伸。（3）運用滾環(huán)機制，此刻的3OH端延伸為一個新鏈。新鏈圍繞著環(huán)狀負鏈模板延伸，直到到達原點并代替原點。（4）在這里A蛋白質與滾環(huán)和替代鏈尾部5端相連，又轉回原點的生長點附近。（5）A蛋白又能識別原點并進

16、行切割，連接在新切割產生的末端，繼續(xù)循環(huán)。（6）完成切割后，被替代的正鏈以環(huán)化狀態(tài)釋放。A蛋白與環(huán)化有關。正鏈產物3端和5端的連接由A蛋白完成，這是每個復制循環(huán)末尾A蛋白釋放反應的一部分，接著又開始下一個循環(huán)。滾環(huán)復制的特點：（1）是單方向和不對稱的半保留復制。（2）產物是單鏈，但是可通過互補鏈的合成轉變成雙鏈。（3）子代分子可能是連環(huán)的，即對應于每個單位基因組的相同DNA分子頭尾相連。（4）連環(huán)DNA隨后被切成于每一單位基因組相對應的小片斷。（5）負鏈通常保持環(huán)狀，因而保留有一套完整的遺傳信息。6.闡明端粒結構與端粒酶的功能。端粒是真核細胞染色體末端的特殊結構，由端粒DNA和與端粒DNA特異

17、結合蛋白組成的核蛋白復合物，廣泛存在于真核生物細胞中，具有特殊的功能。不同種類細胞的端粒重復單位不同，大多數長58bp，且多富含G，由這些重復單位組成的端粒，突出于其互補鏈1216個核苷酸內。人類端粒由5TTAGGG3的重復單位構成，長度在515kb范圍。與端粒特異性結合的是端粒結合蛋白，迄今為止，只在少數生物中確定了端粒結合蛋白的結構及表達基因，然而端粒結構與功能的保守性表明，這些端粒結合蛋白的特性可能普遍適用于其他真核生物。人類細胞中發(fā)現了一種端粒結合蛋白，但人類染色體末端的DNA-蛋白復合體的結構還不清楚。正常的體細胞中，隨細胞分裂次數的增加，端粒逐漸縮短端粒的長度與有絲分裂次數相關，所

18、以端粒又有細胞的“有絲分裂鐘”之稱。端粒酶是RNA與蛋白質組成的核糖核蛋白，是一種RNA依賴性DNA聚合酶。端粒酶的主要作用是維持端粒的長度。它能利用端粒3端單鏈為引物，自身的RNA為模板合成端粒重復序列添加到染色體末端，從而延長端粒的長度。人的生殖細胞、造血干細胞及T、B淋巴細胞中端粒酶有不同程度的表達，而在正常的體細胞中，端粒酶處于失活狀態(tài)，因此體細胞隨細胞分裂次數的增加端粒逐漸縮短。7. 闡述原核生物DNA修復機制（舉3例）。切除修復，又稱切補修復。最初在大腸桿菌中發(fā)現，包括一系列復雜的酶促DNA修補復制過程,主要有以下幾個階段：核酸內切酶識別DNA損傷部位，并在5端作一切口，再在外切酶

19、的作用下從5端到3端方向切除損傷；然后在 DNA多聚酶的作用下以損傷處相對應的互補鏈為模板合成新的 DNA單鏈片斷以填補切除后留下的空隙；最后再在連接酶的作用下將新合成的單鏈片斷與原有的單鏈以磷酸二酯鏈相接而完成修復過程。切除修復并不限于修復嘧啶二聚體，也可以修復化學物等引起的其他類型的損傷。從切除的對象來看，切除修復又可以分為堿基切除修復和核苷酸切除修復兩類。堿基切除修復是先由糖基酶識別和去除損傷的堿基，在DNA單鏈上形成無嘌呤或無嘧啶的空位,這種空缺的堿基位置可以通過兩個途徑來填補：一是在插入酶的作用下以正確的堿基插入到空缺的位置上；二是在核酸內切酶的催化下在空位的5端切開DNA鏈，從而觸

20、發(fā)上述一系列切除修復過程。對于各種不同類型的堿基損傷都有特異的糖基酶加以識別。不同的核酸內切酶對于不同類型損傷的識別也具有相對的特異性。切除修復功能廣泛存在于原核生物和真核生物中，也是人類的主要修復方式,嚙齒動物 (如倉鼠、小鼠)先天缺乏切除修復的功能。重組修復。重組修復從 DNA分子的半保留復制開始，在嘧啶二聚體相對應的位置上因復制不能正常進行而出現空缺,在大腸桿菌中已經證實這一DNA損傷誘導產生了重組蛋白,在重組蛋白的作用下母鏈和子鏈發(fā)生重組,重組后原來母鏈中的缺口可以通過DNA多聚酶的作用,以對側子鏈為模板合成單鏈DNA片斷來填補,最后也同樣地在連接酶的作用下以磷酸二脂鍵連接新舊鏈而完成

21、修復過程。重組修復也是嚙齒動物主要的修復方式。重組修復與切除修復的最大區(qū)別在于前者不須立即從親代的DNA分子中去除受損傷的部分,卻能保證DNA復制繼續(xù)進行。原母鏈中遺留的損傷部分,可以在下一個細胞周期中再以切除修復方式去完成修復。SOS修復。是SOS反應的一種功能。SOS反應是DNA受到損傷或脫氧核糖核酸的復制受阻時的一種誘導反應。在大腸桿菌中,這種反應由recA-lexA系統(tǒng)調控。正常情況下處于不活動狀態(tài)。當有誘導信號如 DNA損傷或復制受阻形成暴露的單鏈時，recA蛋白的蛋白酶活力就會被激活，分解阻遏物lexA蛋白,使SOS反應有關的基因去阻遏而先后開放,產生一系列細胞效應。引起SOS反應

22、的信號消除后，recA蛋白的蛋白酶活力喪失，lexA蛋白又重新發(fā)揮阻遏作用。8. 闡述DNA重組中相關的重要蛋白質。RceA蛋白具有鏈交換，ATP酶及蛋白酶活性。它能結合到ssDNA上，促使DNA分子間的鏈交換，我們將RecA催化單、雙鏈DNA的反應分為三個階段：1RecA結合到單鏈DNA上。2單鏈DNA與其互補物在雙鏈上快速配對反應，產生異性雙鏈連接3單鏈從雙鏈中轉移，取代了雙鏈中的一條鏈。RecBCD是由recB，recC，recD三個基因編碼的三個亞單位組成的酶，具有：核酸外切酶V活性；解旋酶；核酸內切酶；ATP酶；ssDNA外切酶活性。它能結合到雙鏈的上并使雙鏈解旋并分開，當遇到Chi

23、位點時，RecBCD就切開一條單鏈，并失去RecD亞單位，RecBC繼續(xù)解開雙鏈。這樣就得到了鏈交換和重組的位點。Chi是一個被recBCD基因編碼的酶的作用目標。 RuvA辨認Holliday連合處的結構，RuvB是一個解旋酶，并以六聚體形式結合于雙鏈DNA上，解開雙鏈螺旋。ruvC，編碼了一個末端核酸酶，它能確精地辨認出Holliday結合處，結合到Holliday中間產物上，將這樣的結合處分開。9. 闡述易位因子概念和反轉錄病毒復制機制。易位因子：即轉座子，是存在于染色體上可自主復制和位移的基本單位。它可分為簡單轉座子，不含有任何宿主基因也稱為插入序列；復合式轉座子，是一類帶有某些抗藥性

24、基因（或其他任何宿主基因）的轉座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列。反轉錄病毒復制機制：反轉錄病毒的復制是由其自身基因組上pol基因編碼的反轉錄指導完成的，該酶具有以下三種性能：能以RNA為模板合成出第一條互補的DNA鏈（逆轉錄酶活性）；在新和成的DNA鏈上合成另一條互補DNA鏈，形成雙鏈DNA（DNA聚合酶活性）；水解除去RNA-DNA雜合分子中的RNA（Rnase活性，即核糖核酸酶活性）。機制：反轉錄病毒的復制是通過一個RNA分子中間體完成的，是由其自身基因組上pol基因編碼的反轉錄和通過一個RNA分子中間體來完成的反轉錄酶具有逆轉錄酶、DNA聚合酶和核糖核酸酶活性。當反轉錄病毒

25、感染細胞時，pol基因就被宿主的RNA聚合酶轉錄，產生pol mRNA，并在宿主核糖體上合成包括反轉錄酶、整合酶等多個病毒復制和整合所需要的酶類。該反轉錄酶再以病毒RNA 為模板，轉錄出與病毒RNA序列互補的單鏈DNA分子，并以此為模板，利用宿主DNA聚合酶指導合成第二條DNA鏈，以雙鏈DNA形式整合到宿主細胞基因組中，接著就可以被宿主的型聚合酶轉錄。10. 原核生物啟動子所組成的保守序列和終止子特異序列是什么？啟動子是指RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。在原核生物中，在起點上游約-10處找到6 bp的保守序列：TATAAT，稱為Pribnow box，或-10序列。在-35位

26、置，找到又以保守序列：TTGACA，稱為識別區(qū)或-35序列。這兩個序列是RNA聚合酶與啟動子的結合位點，能與因子相互識別而具有很高的親和力。在-35區(qū)和-10區(qū)之間的距離17±1 bp。保持啟動子這二段序列及它們之間的距離是很重要的。終止子：提供轉錄停止信號的DNA序列。所有的原核生物的終止子在終止點之前均有一個回文結構，其產生的RNA可形成莖環(huán)構成的發(fā)夾結構。大腸桿菌中有兩類終止子：不依賴的終止子（簡單終止子）和依賴的終止子。簡單終止子除能形成發(fā)夾結構外，在終點前還有一段由6-8個A組成的序列，所以轉錄產物的3端為寡聚U，另外回文對稱區(qū)通常有一段富含G-C的序列。依賴的終止子必須在

27、因子存在時才發(fā)生終止作用，回文區(qū)無富含G-C，也無寡聚U。11. RNA聚合酶I識別的啟動子包含有哪兩個部分？分別有什么蛋白因子識別？RNA聚合酶只轉錄編碼核糖體RNA的基因，轉錄產物經切割和加工后生成各種成熟rRNARNA 聚合酶I 的轉錄單位有兩段起始調控序列，核心啟動子(Core promoter)和與之相距70bp 處的上游啟動元件upstream promoter element(UPE) （舊稱上游控制元件(Upstream control element，UCE)）核心啟動子(Core promoter)位于起始位點周圍，從-45 延伸到+20，它本身就足以起始轉錄。但是，其效率

28、可被位于-180 到-107 的上游啟動元件（UPE)顯著提高。與一般啟動子相比，這兩個區(qū)域都有不尋常的組成，富含G·C堿基對，而且它們約有85%是一致的。RNA 聚合酶需要UBF1和SL1兩個輔助因子。UBF1 是一個單鏈多肽，它先后與UPE和核心啟動子上富含G·C 區(qū)結合。SL1 因子是一個四聚體蛋白，其作用類似于細菌，本身對于啟動子沒有特異性，但一旦UBF1 結合，SL1 就可以協同UPE結合到此覆蓋的DNA 延伸區(qū)域，可能其主要功能是使RNA 聚合酶正確的定位在起始位點。發(fā)生在兩個部位的結合因子之間相互作用的詳細情況尚不清楚。兩個因子都結合后， RNA 聚合酶就與核

29、心啟動子結合起始轉錄。簡單答案：（RNA聚合酶I識別的啟動子包含-40+50的近啟動子和-165-40的遠啟動子兩部分。近啟動子功能決定了轉錄起始的精確位置，遠啟動子的功能是影響轉錄的頻率。近啟動子有輔助因子UBFl識別，遠啟動子有SL1識別。）12. RNA聚合酶II識別的啟動子含有多種順式作用因子，請舉4例。RNA聚合酶II啟動子涉及眾多編碼蛋白質基因表達的控制，該類型啟動子包含四類控制元件：基本啟動子、起始子、上游元件和應答元件。這些元件的不同組合，再加上其它序列的變化，構成了數量十分龐大的各種啟動子。它們受相應轉錄因子的識別和作用。eg1: TATA box通常位于起始位點上游約25b

30、p處的7bp保守區(qū)，它組成唯一的上游啟動子元件，此元件距起始位點有相對固定的位置，具有定位轉錄起始的功能。它可以在所有真核生物中找到。TATA盒傾向于被富含G*C對的序列環(huán)繞，可能是TATA盒起作用的一個因子。具有選擇定位轉錄點的功能，作為定位因子起作用的eg2: GC box通常在起始位點上游40-70bp處，但在每一個啟動子中，GC盒前后的情況是不一樣的。功能是加強轉錄，兩個方向都有效。eg3: CAAT box約在-75bp處，決定了轉錄的效率，兩個方向都有效。eg4: 核苷酸八聚體（Oct,8bp長的序列元件）能增強真核生物啟動子的轉錄功能。13. RNA聚合酶III識別的啟動子有哪幾

31、類？其定位因子是什么？RNA聚合酶的啟動子有三種類型結構。基因內啟動子有兩種類型，各自含有兩個框架序列，分別被3種輔助因子識別。類型（5SrRNA）由boxA 序列和一個隔開的boxC組成，類型（tRNA）由boxA和一個隔開的boxB序列組成。類型啟動子上的A盒和B盒之間的距離可以變化很大，但兩盒不能過近，太近會失去其功能。有關的轉錄因子包括TFA 、TFB、 TFC。在類啟動子的轉錄起始過程中，首先TFA結合于內部啟動子的boxA，然后TFC結合于boxC然后招募真正的起始因子TFB，TFB最后招募RNA聚合酶。在類啟動子的轉錄起始過程中，首先TFC結合于平boxA和boxB，然后招募真正

32、的起始因子TFB，后者招募RNA聚合酶。TFB含TBP，是定位因子，負責將RNA聚合酶定位于正確的位置。TFB本身不具有結合DNA的能力，RNA聚合酶也不能識別特異的DNA序列。但TFB借助TFC等裝配因子，可精確結合于轉錄起始位點上游，從而使RNA聚合酶結合于轉錄起始位點。（TFB含TBP是真正的轉錄因子，A、C可被高鹽除掉，是裝配因子）RNA聚合酶的第類啟動子位于轉錄起點的上游，這類啟動子有三個上游元件，負責轉錄snRNA的基因，其元件主要包括：Oct-PSE-TATA(Oct 核苷酸八聚體；PSE近端序列元件，提高轉錄效率；TATA區(qū)。它們各自被有關因子識別和結合。有些snRNA的基因由

33、RNA聚合酶II轉錄，究竟是由RNA聚合酶II還是轉錄，似乎由TATA礦的序列決定。關鍵的TATA框由包含TBP的轉錄因子所識別，TBP又與其它蛋白質結合，其中有些對聚合酶III啟動子特異的蛋白質。由TBP 和TAF的功能使RNA聚合酶III正確定位于起點。14. 如何實現真核生物一蛋白基因在大腸桿菌細胞中受控、穩(wěn)定、分泌和高效表達。需要一種高效的原核表達載體，包括一個強大并且可以嚴緊調節(jié)的啟動子；一位于翻譯起始密碼子5端大約9bp的SD序列；位于目的基因3末端的一個高效轉錄終止子。除此之外，載體還需要一個復制起點，篩選標記和利于對啟動子活性進行嚴緊調節(jié)的基因。這種調節(jié)元件可以插入載體自身，也

34、可以插入宿主的染色體。其他的元件包括轉錄和翻譯增強子等。另外，減少E.coli中異源蛋白的降解；使用融合蛋白表達方法高效表達和純化重組蛋白；利用分子伴侶共表達，促進蛋白質翻譯后正確折疊；尋找合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法等都有助于實現真核蛋白基因的高效表達。15. 請闡述RNA SPLICING的基本過程。選擇性剪接（ALTERNATIVE SPLICING）是指同一基因轉錄形成的初級RNA經過不同的剪切和連接方式形成不同的mRNA的過程。是mRNA前體加工過程中一個重要的調控機制，它使得可在低遺傳值條件下產生高度的蛋白質多樣性。真核生物含有限數目的基因，但是當嚴格需要時，真核生物通過一系列精確的工具

35、來加工 mRNA,產生不同的轉錄類型。選擇性剪接屬于復雜性剪接，也就是說，一個基因的初始轉錄物能夠加工產生出不同的 mRNA,從而產生不止一種蛋白質。一個選擇性剪接的例子就是SV40,當它感染細胞時，引導2種蛋白質的合成：大T抗原和小T抗原。這兩種蛋白質表達自同一種前體mRNA，通過2個5'剪切位點及一個共同的3'剪切位點的不同加工過程，表達出2種不同的抗原。一般地，真核生物一個基因的外顯子和內含子的數目及所在位置是固定的。但也可能出現外顯子和內含子數目及所在位置不固定的情況，選擇性剪接的直接后果是一個基因產生多個不同功能的蛋白質。mRNA 選擇性剪接涉及生命現象的很多方面，如

36、細胞分化，個體發(fā)育，免疫機理，某些遺傳病的發(fā)生等等。選擇性剪接在器官發(fā)育中具有重要意義，同樣的基因產生不同的蛋白質，使得不同的組織，不同的器官各自分工，形成真核生物復雜的生命體。同時可以節(jié)省大量的遺傳信息。選擇性剪接使真核生物在蛋白質組水平上表現出極高的復雜性，這就是人類的基因數目只有3 萬多個，卻有比其他生物高得多的進化程度的一個重要原因。16. 請闡述核酶概念及應用的研究進展。核酶(ribozyme)是一類具有催化活性的RNA 分子,可通過堿基配對特異地與相應的RNA 底物結合,并在特定的位點切割底物RNA 分子。自美國科學家Cech 和Altman 等發(fā)現核酶至今的20多年來,人們利用核

37、酶可以特異性地切割靶RNA序列的特點,通過設計合適的核酶阻斷特定基因的表達,已相繼對獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤、生殖系統(tǒng)疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反應等進行了廣泛深入的研究。核酶的種類很多，從結構上看主要有發(fā)夾狀核酶(hairpin ribozyme)和錘頭狀核酶(hammerhead ribozyme)。從目前來看，核酶的應用主要在基因治療上。即將核酶基因導入細胞內，使其在細胞內表達出相應的核酶，從而對mRNA進行切割，在翻譯水平阻止某些基因的異常表達，達到治療疾病的目的。核酶的應用舉例：1核酶在腫瘤治療中的應用主要集中在以下幾個方面核酶與癌基因：核酶獨特的切割目的基因的方式有可能阻

38、斷癌基因的表達, 從而逆轉腫瘤細胞惡性增殖, 并誘導其分化和凋亡。核酶與多藥耐藥性：多藥耐藥性(Multidrug resistance, MDR) 是腫瘤化療失敗的主要原因。設計核酶抑制耐藥相關基因的表達，使耐藥的腫瘤細胞重新獲得對化療藥物的敏感性。核酶和端粒酶：在高等生物細胞中, 除了精原細胞和少數造血細胞存在端粒酶活性外, 其余體細胞的端粒酶均處于失活狀態(tài)。而當細胞惡變時, 端粒酶則被激活, 使端粒酶長度不隨細胞分裂而丟失, 從而使細胞逃避老化死亡, 保持無限復制與增殖。現在, 人們已經開始應用核酶技術通過抑制端粒酶活性, 從而抑制腫瘤細胞的增殖。2核酶在抗病毒中的應用抗艾滋病病毒HIV

39、：HIV的長末端重復序列(LTR)參與病毒蛋白生成的調節(jié)，起著類似“開關”的作用。HIV感染人體后，病毒的RNA在逆轉錄酶作用下合成DNA，然后整合到細胞染色體上，可長期潛伏。只有某些特定的激活因子作用于已整合人細胞基因的 HIV 前病毒LTR時，才能啟動表達，或使表達從低水平轉入高水平。利用特異性核酶在細胞內抑制HIV-1的LTR mRNA表達，能明顯降低細胞HIV-1病毒蛋白的表達水平，從而達到抑制病毒復制的作用。抗乙肝病毒HBV：核酶能特異地切割HBV前基因組RNA , 使其喪失模板活性, 如針對HBcAg mRNA 設計的核酶, 可有限的剪切HBV mRNA; 針對HBV 前C/C區(qū)基

40、因設計的錘頭狀核酶, 經體外轉錄后可定點切割靶RNA等。從而起到抗病毒的作用。盡管核酶已經開始應用于人體內治療,但尚有許多問題有待解決。例如:如何獲得高效、無毒的特異性核酶,如何選擇靶序列中最佳切割位點,如何提高核酶進入靶細胞的效率并穩(wěn)定發(fā)揮作用等。17. 請闡述Aminoacyl tRNA synthetases 在蛋白質翻譯中的作用。在蛋白質翻譯中，每種tRNA分子在它到達核糖體之前都需與相應的氨基酸結合，這種結合是在一系列被稱為氨酰-tRNA合成酶作用下完成的。大多數細胞可產生二十種不同的氨酰-tRNA合成酶，每一種酶既識別tRNA，又能識別氨基酸，對兩者都具有高度專一性。它們各不相同，

41、各負其責，使一種氨基酸與其相應的一套tRNA分子結合。這些酶可以將正確的氨基酸裝載到相應的tRNA分子上，于是，tRNA就可以執(zhí)行它從DNA的脫氧核糖核苷酸序列信息到蛋白質的氨基酸序列信息的翻譯功能，保證了蛋白質翻譯的真實性。18. 在翻譯水平上解釋為何真核生物通常具有單順反子結構，而原核生物卻具有較多的多順反子結構。原核細胞中幾個功能相關的結構基因常串聯為一個轉錄單位，可以編碼幾種功能相關的蛋白質，稱為多順反子。真核的mRNA只編碼一種蛋白質，稱為單順反子。真核生物翻譯過程蛋白因子種類很多，可以很好得調控表達產物的量，這對于細胞生理的精細調節(jié)是十分必要的。在原核生物中，轉錄和翻譯同時進行。多

42、順反子mRNA在進行翻譯時，通常核糖體完成一個編碼區(qū)的翻譯后即脫落和解離，然后在下一個編碼區(qū)上游重新形成起始復合物。多數多順反子的翻譯獨立發(fā)生；但在某些細菌中，mRNA相鄰順反子翻譯直接相連，可由一個核糖體翻譯。真核生物的mRNA前體在細胞核內合成，合成后需經加工，才成熟為mRNA，從細胞核輸入胞漿，投入蛋白質合成。成熟mRNA上只含一條多肽鏈的遺傳信息，合成蛋白質時只有一個合成的啟動點，一個合成的終點。真核生物翻譯過程蛋白因子種類很多，可以很好得調控表達產物的量，這對于細胞生理的精細調節(jié)是十分必要的。而在原核生物通過蛋白因子進行調控的途徑有限，而多順反子則可以通過mRNA中不同蛋白編碼序列與

43、起始位點的距離進行表達量的調控。mRNA上有多個核糖體存在時，第一個順反子的翻譯會破壞mRNA原有的二級結構，使核糖體能夠與下一個順反子的翻譯起始區(qū)域結合。通過翻譯弱化和翻譯偶聯在翻譯水平上進行精確調節(jié)，具有重要意義。19. 分析大腸桿菌乳糖操縱子的正負調控機制。大腸桿菌乳糖操縱子包括三個結構基因：Z，Y和A，以及啟動子，控制子和阻遏子等。轉錄時，RNA聚合酶首先與啟動區(qū)結合，通過操縱區(qū)向右轉錄。轉錄從啟動區(qū)開始，按Z-Y-A方向進行，每次轉錄出來的一條mRNA上都帶有這三個基因。轉錄的調空是在啟動區(qū)和操縱區(qū)進行的。正調空機制：cAMP-CAP復合物與 DNA結合改變了這一區(qū)段 DNA次級結構

44、，促進了RNA聚合酶結合區(qū)的解鏈。這可能是cAMP-CAP通過與RNA聚合酶結合，再與DNA結合，因而促進了RNA聚合酶與啟動子的結合，從而增強了轉錄。cAMP-CAP復合物的形成取決于細胞內cAMP的濃度，當以葡萄糖為能源時，由于其抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，ATP不能轉化為cAMP，細胞內cAMP濃度降低，形不成CAP-cAMP復合物，因而乳糖結構基因不被轉錄。負調空機制：具有活性的阻遏物只要結合在操縱基因上，就可以阻擾RNA聚合酶的轉錄活動，這是由于P和O位點有一定的重疊序列，O被阻遏物占據后，RNA聚合酶便不能結合到P位點上。阻遏物有無活性又受乳糖這種小分子誘導物的影響。阻遏物與乳糖結合后

45、，由于發(fā)生構象變化而失活，不再能同操縱基因結合，于是RNA聚合酶便能結合于啟動子，起動基因的表達，使乳糖利用的結構基因轉錄出相應的mRNA，進而再翻譯出蛋白質。在酶誘導合成的這個調節(jié)系統(tǒng)中，阻遏蛋白是主要的作用因子，而誘導物可以影響阻遏蛋白的活性，只有阻遏物被誘導失活，結構基因才得以表達。20. 解釋大腸桿菌色氨酸操縱子的調控機制。21. 解釋大腸桿菌半乳糖操縱子的兩啟動子調控機制。大腸桿菌半乳糖操縱子(galactose operon)包括3個結構基因galE galT galk分別編碼3種酶。這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。GalR與galE、T、K及操縱區(qū)O等離得很遠，而g

46、alR產物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。分析gal操縱子P-O區(qū)的DNA序列發(fā)現，該操縱子存在兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結合位點S1和S2。從S1起始的轉錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時，才能順利進行，RNA聚合酶與S1的結合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。從S2起始的轉錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉錄。當有cAMP-CAP時，轉錄從S1開始，當無cAMP-CAP時，轉錄從S2開始。為什么gal操縱子需要兩個轉錄起始位點？半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關的

47、物質-尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產物。生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構酶。如果只有S1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就不能合成異構酶。假如唯一的啟動子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導狀態(tài)，這無疑是一種浪費。無論從必要性或經濟性考慮，都需要一個依賴于cAMP-CAP的啟動子（S1）對高水平合成進行調節(jié)，以及一個不依賴于cAMP-CAP的啟動子（S2）進行本底水平的永久型合成。21. 解釋大腸桿菌HSP蛋白在溫度變化時的調控機制。在正常狀態(tài)下，HSF以無活性的單體形式存在于細胞漿中，并與某些HSP結合在一起。溫度升高時，胞漿中的變性蛋白質增多。這些變性蛋白的折疊發(fā)生改變，暴露出分子內部的疏水區(qū)域，從而導致HSP與其結合。HSP與受損傷蛋白質結合后釋放出HSF單體，HSF單體再聚合成具有轉錄活性的的三聚體。經過磷酸化修飾，HSF三聚體向