1、 生化分析儀的基礎與應用生化分析離不開生化分析儀。所謂生化分析一般是指以吸光光度分析為基礎的（有的包含離子選擇電極等測定方法）、具有樣品取樣及加試劑、混合、保溫反應等測定。分析過程監控和數據處理及輸出能力的半自動或全自動儀器。它們的分析方法都以儀器和試劑為基礎，以方法學為指導標準來規范，以試驗參數來聯系體現。所以，首先必須了解儀器、試劑和方法學的原理及特點，其次是利用方法學評價對儀器、試劑及參數在實踐中作評價，以保證分析的精密度和準確度，提高成本效益。實驗證明，單色光經過有色溶液時，透過溶液的光強度不僅與溶液的濃度有關，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對光的吸收性能有關。其規律可用下式表示為 A

2、KCL 式中：A（E）吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K某溶液的消光（吸收）系數； C溶液的濃度； L光程，即溶液的厚度。 可見、收光譜法的定量基礎是朗伯比爾（Lambert-Beer）定律： A=lgI o/ I t =-lgT=lg1/T 吸光系數即當一束強度為L的平行單色光通過一個含有濃度為C的吸光物質、厚度為L的吸收他時，光的一部分被吸收，光強度從IO減小至It。當吸光系數k一定時，透過光與濃度或厚度呈指數函數關系，但吸光度（absorbance，A）與濃度或厚度呈簡單的正比關系。 在濃度、厚度、單色光波長、溶劑及其溫度等相同條件下，不同吸光物質的吸光度不同，即它們的吸光系數（

3、absorptivity）不同。是物質的特性常數，它只和該物質分子在基態和激發態之間的躍遷幾率有關。它的物理意義是吸光物質在單位濃度及單位厚度時的吸光度，常用的表示方式是摩爾吸光系數（molar absorptivity）。摩爾吸光系數即1摩爾濃度的溶液在厚度為 1cm時的吸光度。在吸光度與濃度之間的直線關系中，吸光系數是斜率，其值愈大，測定靈敏度愈高。 應用注意點： 1由于物質對不同波長的光有不同的吸光系數，Beer定律成立的重要前提之一是單色光，即只有一種波長的光。但在實際測定中，入射光常常并非嚴格的單色光，常有不同波長的輻射同時存在。此種多色輻射是使測定中吸光度的變化偏離Beer定律（常

4、為負偏離）的主要光學影響因素。單色光的純度可用譜帶寬度（bandwidth）衡量。單色光源是用分光光度計由單色器或濾光片從連續光譜的多色光中選擇的、最大吸收波長max在內的一小段波長范圍的復合光。以譜帶寬度較小、吸收峰較寬的max作為測定條件。 2Beer定律一般適用于稀溶液的測定 有兩層含義：被測物的濃度不宜過大，其吸光度應在相對測量誤差較小的區域；溶液在反應中存在化學平衡，受濃度、pH、溶劑和溫度等因素的影響。 3介質不均勻引起偏離 當待測試液是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時，入射光因一部分散射損失，使透光率減小，實測吸光度增加。 比濁法及免疫濁度反應的特點 比濁法與可見、紫外吸收光譜法不同，

5、它們不是測定澄清溶液而是測定懸浮液或膠體溶液中物質的濃度，分析的光學基礎是分散顆粒對光的反射、折射、散射和吸收等多種作用。生化分析儀通過免疫比濁法等技術，架起臨床生化與現代免疫技術的橋梁，免疫化學法的應用日益廣泛。 1比濁法的分類及原理在光源的光路方向上測量透射光（實際包括透射光和散射光）強度與入射光強度的比值和被檢溶液中顆粒濃度間的關系，稱為透射比濁法（turbidimetry）。在光路的一定角度（一般為5o90o）方向上測量散射光強度和被檢溶液中顆粒濃度間的關系，稱為散射比濁法（nephelometry）。 透射比濁法的計算公式是： In（IOI）b令=23kclgI o/ I kbc 即

6、當一束強度為I o的平行光通過一個散射顆粒濃度為c混濁介質厚度為b的稀的懸浮液后，人射光被吸收和散射，光強度衰減至I，在濁度系數為時，透過率與顆粒濃度呈線性關系。 散射光強度與懸浮液或膠體溶液中的顆粒質點大小、入射光波長大小及二者的比例有關。顆粒直徑接近或大于光源波長時，常呈透射光和光路上的向前散射光，其散射光強度與入射光強度的關系遵從Mie散射理論，光散射隨波長的變化小。顆粒遠小于光源波長（d小于005）時常呈偏離光路方向、900對稱分布的散射光，其散射光強度與人射光強度的關系符合Rayleigh散射定律，波長愈短，散射光愈強。 一般比濁法的靈敏度不如可見、紫外吸收光譜法，但免疫濁度法的敏感

7、度約為50ngrnl。聚合劑（如聚乙二醇600010000）可提高免疫復合物的形成速度。膠乳增強免疫濁度法（latex enhanced turhidimetric immunoassay）由于采用顆粒較大、折光性強的膠乳，將抗體經吸附或共價交聯反應固定于膠乳表面，增加抗原抗體凝聚體積，減少透過光，使靈敏度提高到近1ngml水平。散射比濁法的靈敏度比透射比濁法高，但干擾因素較多。比濁法的精密度相近，變異系數為155。目前，由于技術發展，兩種比濁法的靈敏度和特異性已接近，而全自動生化儀的自動化程度和精密度要勝于專用散射比濁儀，故透射免疫比濁法在臨床上的應用日益廣泛。速率法的靈敏度和特異性都優于終

8、點法，但終點法的穩定性較好。2免疫濁度反應的特點抗原抗體反應與其他化學反應不同，在免疫濁度反應中，抗原抗體復合物的生成量和生成顆粒的大小，與反應體系中抗原抗體的比例關系極大抗原相對不足時，生成的免疫復合物沉淀量少；抗原抗體比例合適時，復合物生成量達到峰值；抗原過量時，復合物反而再溶解，沉淀量下降。臨床上免疫比濁法多用抗體測定抗原，保證抗體足量、防止抗原過量是基本的方法學條件。要使在臨床常見的高抗原濃度范圍內（至少高于正常參考上限 50 ）抗體也足以與之反應，只有這樣，抗原抗體復合物的生成量才隨抗原的增加而遞增，光散射的強度才與抗原量成比例。抗體不足時，測定結果往往偏低。 3應用注意點 （l）若

9、懸浮顆粒本身具有特征吸收，則吸收作用是主要的，宜選擇最大吸收波長作比濁測定；若懸浮顆粒本身無特征吸收而介質對人射光有吸收，則測定必須選擇在高透光度的波長區。若懸浮顆粒小（粒徑小于35nm），溶液濁度小，透射比大于90%，不宜選用透射比濁法，應選擇散射比濁法測定。 （2）透射比濁時，35100nm大小的微粒在波長290410nrn下有最大吸收峰，免疫復合物的大小大致在此范圍。散射比濁時，較大的散射光角度適用于35100nrn大小的微粒，較小的散射光角度適用于100800nrn間的微粒。血漿中的白蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白等微粒直徑多在50nrn以下，其散射光是對稱的。IgM、乳糜顆粒、免疫反應初期

10、產生的抗原抗體復合物等顆粒的直徑在50-400nrn，都屬顆粒直徑接近或大于光源波長這一類，其散射光是不對稱的。 （3）非特異性光散射的影響：免疫濁度法常受內源性光散射的干擾。血清中的乳糜微粒、VLDL、LDL以及反應體系中的顆粒都會產生雜散光，影響比濁靈敏度。為避免上述影響，樣品組分的比例，透射比濁法宜在3以下，散射比濁法應在05以下。所用的試劑要澄清，必要時經022m濾膜過濾。應作試劑空白和樣品空白。（4）帶現象（zone nhenomenon）的影響：抗原或抗體過剩使免疫復合物部分或全部解離的現象，稱為帶現象。免疫濁度測定中常表現為抗原過剩時免疫復合物形成的量反而下降，又稱鉤狀效應（ho

11、ok effec）。克服辦法主要是：采用高質量試劑，設置儀器監測，減少血清用量。（5）偽濁度的影響：即不是特異性抗原抗體反應產生的免疫復合物形成的濁度。形成原因復雜，主要是抗血清存在的非特異性交叉反應性雜抗體成分，增濁劑濃度過高和反應時間掌握不當，樣品本身的濁度處理不當，試劑污染和變質，比色杯不潔，等等。 （6）校準與計算：應選用適當的校準品及濃度作劑量反應曲線。曲線往往有截距或呈S形，不成直線。自動生化分析儀多推薦5點或6點定標，然后選擇適當的數學模型作曲線擬合，如 IngitLog變換或 y dcx bx2 ax3的 3次方程回歸曲線。更換試劑批號時也必須重新校準曲線。 （三）均相酶免疫分

12、析酶聯免疫分析利用免疫反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性對抗原或抗體進行測定，均相酶免疫分析（homogeneous enzyme immunoassay）是其中的一類。在均相酶免疫分析中，最常用的是酶放大免疫分析（enzyme multiplied immunoassay，EMIT）。其原理是：當酶標抗原（半抗原）與相應抗體結合，生成酶標抗原抗體復合物后，對標記酶產生調節作用，使酶的構象改變，酶活性抑制、恢復或增強，酶催化的信號隨之發生改變；酶標抗原抗體復合物與游離酶標抗原同處一相，不需分離步驟就可測定酶活性，計算出被檢抗原（半抗原）的含量。常采用酶標抗原與未知抗原對特異性抗體的競爭反應

13、：抗原與標記酶結合使酶的活性抑制或激活，再與相應抗體結合后其酶活性被激活或抑制，未知抗原和酶標抗原與抗體形成競爭體系。 均相酶免疫分析目前主要用于檢測小分子半抗原，如某些激素、藥物或代謝產物，也逐漸用于大分子物質，如血清 IgG測定。測定藥物的靈敏度一般為 0 5 2gml。方法簡便、快速，準確性和重復性好，但影響酶活性的因素也必然影響酶聯免疫分析。 克隆酶供體免疫分析（cloned enzy。 donor immunoassay，CEDIA）是有發展前途的均相酶免疫技術，靈敏度比一般酶免疫法高。其原理為：用基因工程技術制備稱為酶供體（ED）和酶受體（EA）的兩肽段。ED和EA獨立存在時無酶活

14、性，但在合適條件下可以自動裝配并聚合成具有酶活性的四聚體。ED標記申抗原小分子或抗原大分子后，不影響其與EA的裝配，但當相應抗體存在時，抗原抗體結合后形成的空間位阻使酶的裝配受阻，使用競爭結合模式即可檢測末知的半抗原或抗原。 (四)酶促反應的特點： 由酶催化的反應稱為酶促反應。以酶作為試劑來進行分析測定，或通過酶促反應測定待測酶的活性，具有高效、專一、溫和、靈敏的特點，廣泛用于生化分析。試劑中的酶活性（濃度）在反應過程中始終不變。下面僅對酶活性測定知識作介紹。 1酶活性測定 生物體內含有成千種酶，存在于細胞中。當細胞通透性增加或細胞破裂時，會使體液中酶濃度增加，因此測定體液中特別是血液中酶濃度

15、的變化有助于臨床診斷疾病、判斷預后和觀察療效。血液中的酶含量甚微，一般每毫升含量在微微克（Pg）到毫微克（ng）水平，因此要直接測定酶含量是非常困難的。雖然近年免疫學技術發展迅速，可以對某些酶直接進行測定，但目前臨床仍以測定酶活性間接推算酶的含量。 酶活性的大小，是在一定條件下通過測定酶促反應過程中單位時間內底物的減少量或產物的生成量引起的吸光度變化，即測定酶促反應的速率來獲得的。一般情況下，產物和底物的濃度變化是一致的，但測定產物的生成要比測定底物的減少為好。這是由于反應體系中使用的底物往往是過量的，反應時間通常又很短，尤其在酶活性很低時，底物減少量僅占加入量的很小比例，因此測定不易精確；反

16、之，產物從無到有，只要測定方法靈敏，準確度可以很高。所以，酶活性測定大多數采用測定產物生成速率的方法。2酶促反應三階段酶促反應是一個可逆反應，其反應全過程的速率并不都與酶活性成正比。將酶促反應過程中測得的產物或底物的變化量對時間作圖，得到酶促反應時間進程曲線， 圖中產物P或底物S的濃度變化曲線的斜率就代表酶反應速率。酶促反應一般分為三階段。 （1）延滯期（lag phase）：底物與酶混合、反應啟動后的一段短時間內，產物從零開始逐漸生成，處于較低水平，反應速度較低，未達到待測酶最大反應速度；另外，在酶偶聯反應中，指示酶的反應必須有一定量測定酶的產物堆積才能進行；這些都使酶反應要稍待一定時期后，

17、吸光度才有明顯的線性變化，這一時期稱為延滯期。延滯期的長短不一，當反應體系中存在抑制劑或有干擾物質參與的副反應時，延滯期可延長；當樣品酶活性過高或反應體系中存在激動劑時，延滯期可縮短。 在開始酶反應（即待測樣品與基質混合）之前，應有一個預孵育期（preIncubation period），讓所有可能干擾測定的反應充分進行，避免干擾待測酶活性。內源性產物被工具酶催化消耗，內源性底物也通過偶聯反應充分消耗，然后加入底物啟動反應。 （2）線性期（linear。base）：在反間應體系中底物大于酶飽和濃度的情況下，產物或底物的變化量隨反應時間呈線性增減，即反應速度（單位時間內產物或底物的變化量）恒定不

18、變，這一時期稱為線性期或恒態期，亦稱零級反應期。在此期，反應速度不受底物和產物濃度的影響，只與酶活性濃度呈線性關系。測定酶活性都在零級反應期進行。 (3）偏離線性期：隨著反應時間的延長，反應體系中的底物不斷消耗，酶不能被其飽和，以及可逆反應、產物抑制、酶變性失活等原因，致酶促反應速度下降，產物或底物的變化曲線漸趨平坦，這一時期稱為偏離線性期，亦稱一級反應期。在此期，反應速度不僅與酶活性濃度有關，還受底物濃度影響，與底物濃度成正比，因此不能準確反映酶的真正活性，產物濃度與反應時間不呈線性關系。 二、自動生化分析儀的基本結構及工作原理 (基本結構) 1按照反應裝置的結構，自動生化分析儀主要分為流動

19、式（flow system）、分立式（discrete system）兩大類。 （l）流動式：指測定項目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學反應在同一管道流動的過程中完成，這是第一代自動生化分析儀。 （2）分立式：指各待測樣品與試劑混合后的化學反應都是在各自的反應杯中完成的，其中有幾類分支。 l）典型分立式自動生化分析儀：此型儀器應用最廣。 2）離心式自動生化分析儀：每個待測樣品都是在離心力的作用下，在各自的反應槽內與試劑混合，完成化學反應并測定。由于混合、反應和檢測幾乎同時完成，它的分析效率較高。 3）袋式自動生化分析儀：是以試劑袋來代替反應杯和比色杯，每個待測樣品在各自的試劑袋內反應并測定。

20、 4）固相試劑自動生化分析儀：亦稱為子化學式自動分析儀，是將試劑固相干膠片或濾紙片等載體上，每個待測樣品搞加在相應試紙條上進行反應及測定。操作快捷、便于攜帶是它的優點。 生化分析儀的正確應用只是掌握了測定技術原理還不夠，還需要對具體儀器的工作流程及測定計算方法有足夠了解。1一般工作流程工作流程可以通過儀器的測定周期來考察。重點關注比色杯空白讀數點（CB）、加樣品點（S）、各試劑加液點（R、R2、）、試劑空白讀數點（RB）、各測定讀數點（P）、各點時間間隔及周期總時間等。每個儀器一般都在反應轉盤的固定位置和反應測定周期的固定時間設置樣品、試劑和稀釋的加液位，以及（始點測定吸光度一始點空白吸光度）

21、。如HITACHI7170在P1至P34周期為10分鐘具體工作流程如圖2-2所示 圖2-2 2數據處理計算方法 儀器在各個吸光度讀數點讀取的吸光度數據，并不一定都納入濃度計算。儀器往往根據儀器定義和操作者設定的要求，對吸光度原始數據作計算處理，轉換成所謂的反應數據，再按系數或公式作濃度計算。舉例如下： （1） HITACHI 7170的終點法：測定點（AX）吸光度計算為（AX AX-l）2，實際吸光度=吸光度數據×10000。 （2） OLYMPUS AU600試劑空白數據： PO點試劑空白（RB） PO點吸光度一比色杯水空白（WB）；任一測定點試劑空白（RBX）=該點吸光度一比色杯

22、水空白（WB）。 （3） Monarch 1000兩點終點法的反應數據=（終點測定吸光度一終點空白吸光度）（始點測定吸光度一始點空白吸光度） （4）AU600終點法（帶試劑空白，END法）的反應數據=終點吸光度一PO點吸光度（試劑空白，RB）。終點法（不帶試劑空白，ENDI法）的反應數據=終點吸光度一比色杯空白（WB）。 （5）AU600兩點法（自身空白）的反應數據二（加第二試劑后測定點讀數-PO點讀數）（加第二試劑前測定點讀數-Po 點讀數）。 1儀器運行前操作程序主要進行儀器的基本設置。 (1) 試驗項目設置：對試驗名稱、編碼、試驗組合（profile）、試驗輪次（round）、必要時包括

23、試驗順序等設置。 （2）各試驗的參數設置：包括試驗間比值、結果核對等參數的設定。 （3）試劑設置：根據有關試驗參數設置各試驗的試劑位、試劑瓶規格，必要時設定試劑批號、失效期等。 （4）校準品設置：對校準品的位置、濃度和數量等進行設置。 （5）質控設置：根據質控要求設置質控物個數、質控規則、質控項目及相應質控參數等。 3測定結果的檢查分析 (1)要了解和熟悉儀器的各種警示符號的含義與作用：在正確設定參數的前提下利用各種警示符號能提高我們發現問題和解決問題的效率。 （2）要熟悉和靈活運用儀器的相關操作屏（界面）：如用反應過程監測觀察反應時間進程曲線；用校準追蹤（calibration trace）

24、回顧分析校準曲，利用統計（statistics）了解不同日期段病人測定均值及數據分布；運用分析數據編輯察看和校正測定數據。 （3）校準的檢查：要充分利用儀器設置的功能檢測校正曲線圖形、各校準點吸光度值（不能忽略試劑空白值及空白速率值）計算K值等的波動情況，以及以往的比較。必要時應進一步檢查反應時間進程曲線。必須結合質控數據來把握實踐條件。 （4）病人結果的檢查：除了目測觀察或用血清指數了解標本性狀、注意和了解臨床及診斷外，學會分析反應時間進程曲線及數據是重要的基本功。四基本測定方法 1終點法（end point method）根據反應達到平衡時反應產物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對物質進行定

25、量分析的方法。對一般化學反應來說，反應完全（或正、逆反應動態平衡）、反應產物穩定時為反應終點。對抗原一抗體反應來說，是抗原和抗體完全反應、形成最大且穩定的免疫復合物時為終點。在反應時間進程曲線上為與X軸平行的區段。在測定計算方式上，一般分為一點法和兩點法兩種。 (1) 一點法（one point）：以試劑和樣品混合之前的空氣空白（GB）、水空白（WB）或試劑空白（RB）的吸光度值為測定計算基點，以反應終點的吸光度讀數減去空白讀數，得到反應吸光度。通過與相同條件下校準液反應吸光度的比較，求得測定結果。常與一點校準法配合使用，即采用一個校準濃度，校準曲線通過零點且成線性。也應用多點校準。 （2）兩

26、點終點法（two point end）：即終點-始點法。以試劑和樣品混合之后的某一時間點作為始點，以反應終點的吸光度讀數減去始點讀數。一定條件下可降低樣品對反應或反應本身的非特異性干擾（主要指色度干擾）。常采用雙試劑，多以加 R2前某一點作為測定始點；某些情況下，也可以加 R2后一點作為測定始點。若使用單試劑，主反應啟動太快或儀器起始讀數點受限時難以運用。 固定時間法（fixed method）與兩點終點法的區別只是在：測定讀數的末點不在反應平衡區段，而是根據方法學選擇，如血清肌肝（苦味酸法）測定。 （3）三點終點法：即雙終點法，在一個通道內一次進行兩項反應相關的終點法測定，比如同測游離脂肪酸

27、和甘油三酯。某些儀器（如 HITACHI系列）設置此方法。 2連續監測法（continuous monitoting method）又稱速率法（rae assay）即連續監測反應過程，根據所測定的產物生成或底物消耗的速度進行定量分析的方法。在反應時間進程曲線上為反應呈恒速區段（斜率保持不變），常用于酶活性線性反應期測定。 (1) 連續監測法：即零級反應速率法，亦稱斜率法。在較長的反應時間區段內（至少90120秒），每隔一定時間（常為230秒）讀取一次吸光度值，至少讀取4點，得到3個A；一般將連續多次讀數作最小二乘法處理，讀數間隔時間太短的作帶速率時間(TR）多點法處理，均取線性反應部分的讀數，

28、求出單位時間內的反應速率Amin。此法必須以零級反應為測定計算的基礎，因為只有在零級反應下，單位時間內的吸光度變化反應速率 Amin）才與酶活力呈正比。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準確性。但是，半自動生化分析儀采用單樣品連續監測，相當耗時。 應用連續監測法，首先應準備線性范圍內的高、中、低濃度的樣品，分別作反應時 （2）兩點速率法：即所謂的擬一級速率法。在反應中選取兩時間點t1、t2，讀取吸光度A1、A2，計算（A1A2）（t1t2）=At。此方法與兩點終點法的區別主要有兩點：后一讀數點反應未達終點，以速率計算結果。與連續監測法比較，其缺點在于人為確定t1、t2，不定因素較多，

29、不能保證反應在t1t2期間呈線性，影響結果的準確性。 應在常規測定前先做預試驗來確定線性時間段；若在選擇的時間段內反應不成線性（如零級反應期短，儀器無法設置或測定），則只能改用終點法。優點在于方法簡單，酶活力較低，測定吸光度值較小時，可增加測定時間段而不受儀器連續監測時間點的局限，減小了讀數誤差。 （3）速率B法：在一個通道內一次進行兩項反應相關的速率法測定。它既可以是兩項試驗測定，也可用于干擾或及樣品空白自動補償。后一用途的原理是：利用儀器的微機自動處理，在第一反應（干擾反應）一直維持線性的前提下，可以從第二反應（主反應）速率中扣除第一反應速率的延續影響。如可用于消除膽紅素轉化為膽綠素后吸光

30、度下降、對肌酥苦味酸法測定的負干擾，等等。某些儀器（如 HITACHI系列）設置此方法。 3，空白（blank）校正在分光光度法中，常利用空白溶液來調節儀器的吸光度零點，或用來抵消某些測定的干擾因素。在生化分析儀測定中，除了采用雙或多波長、兩點法等排除背景干擾外，常要運用專門空白測定，以便從樣品測定吸光度中扣除其影響。正確選擇空白校正，對提高準確度起著重要作用。 （l）試劑空白：一般在方法類型和校準模式中，即分為有或無試劑空白兩大類。試劑空白單獨測定或與校準配合測定，并需預先裝載去離子水樣品杯或試劑空白架。校準或病人樣品各測定點的吸光度，均要扣除相應測定點的試劑空白吸光度或空白速率值。 在不少

31、儀器中，試劑空白測定類似校準測定，并非在病人樣品測定時實時測定。所以，要注意它的測定頻率，避免因試劑批號或質量變化造成試劑空白的改變而引起計算誤差。 （2）樣品空白：主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法，測定校正結果=顯色反應通道結果-空白通道結果。多數儀器須另外占用測定通道，分析速度減半，但去干擾的準確性應高于兩點終點法。 三、自動生化分析儀的基本參數及應用 了解生化分析儀基本參數的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測定數據。但是，配套系統的原裝分析參數不宜更改；采用非儀器配套的試劑及校準品體系時，參數修改要慎重。對于不同儀器、不同類型的反應分析程序，所

32、顯示的人機對話分析參數的信息有所不同。 （一） 反應測定時間 多數全自動生化分析儀可以在整個測定反應周期內連續監測（如 HITACHI 7170常規測定周期 10分鐘，監測 34點，OLYMPUS AU600固定周期 8分 15秒，監測 27點），但反應監測時間是指該時間內的測定讀數要用于結果計算。它的設置與加樣點、加試劑點（包括R1、R2）、監測時間（讀數點）、讀數間隔時間及試劑樣品比例等有關，要結合方法學兼顧權衡。1反應時間（reactfon time）指儀器的一個分析周期中，試劑和樣品混合到最末一點測定讀數的時間。它對終點法尤其重要，是終點法的瓶頸。有的儀器有多個反應時間可選（如 HIT

33、ACHI 7170），須預先選定。多數儀器為 10分鐘左右，這對試劑提出了較高要求。不少終點法試劑（尤其手工法試劑）反應時間常常也在10分鐘上下，測定時間沒有余地，當樣品濃度高或試劑質量下降時，均可致測定結果偏低。因此，終點法不宜采用標明反應時間接近和長于儀器最大反應時間的試劑盒。不得已時必須用接近測定范圍上限的高濃度質控血清監測。2監測時間（讀數點）和讀數間隔時間各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數間隔時間短，監測時間也短。流動式生化儀讀數間隔時間一般較長。分立式生化儀一般監測時間10分鐘左右，間隔1030秒讀數一次。有的儀器在整個測定反應周期全程讀數，有的只讀取指定時間（點）的吸光度。3加

34、試劑點 采用雙試劑時，加 R2點決定 R1與樣品的反應時間，也決定 R2與R1及樣品的反應時間。一般儀器各5分鐘左右。 HITACHI 7170有四個加試劑點，若采用雙試劑，各5分鐘，則加R2設在第3加試劑點。 4反應監測時間還要考慮延遲時間的長短、測定物質的濃度范圍及相關臨床價值。工作效率等因素。 （二）延遲時間 延遲時間（delay time）是指試劑與樣品混合后到監測開始之間的時間。一般用于兩點法和速率法，某些情況下也用于終點法。終點法應選擇反應趨于平衡的時間（穩定期或平衡期）作測定，測定點前即所謂的孵育期。速率法的線性反應期之前即延遲期。正確選擇延遲時間的長短，有利于準確測定，減少試驗

35、誤差。設置一般根據試劑盒的說明書，還應考慮本室的儀器特點和工作程序。 1儀器特點 比如半自動生化儀多為流動比色池，要考慮泵速、進樣管長短。反應液粘稠度及混合情況，以及室溫、反應液溫度同反應要求溫度間的溫差，等等。全自動生化儀的測定讀數設置方式不同，直接以“秒”設置，或以測定點設置，測定點間隔時間不一樣，需要靈活掌握。 2試劑及方法學 （l）試劑組成：在酶活性的連續監測法時，若試劑含工具酶數量多、偶聯反應多，則激活反應時間一般較長，延遲時間也較長，如肌酸激酶（NAC法）延遲時間常設置120180秒；若試劑中底物經待測酶催化，其產物可以直接測定的，則延遲時間較短，如 -谷氨酰轉移酶（GGT）設定

36、30 60秒。同一項目同一方法，但試劑配方不同，其反應快慢等特征也可能不同，如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠（BCG）為即時反應，10秒鐘內已完成，其后、球蛋白等也將與BCG發生反應，所以孵育時間不能延長。但在同一測定時間，BCG濃度、緩沖液種類、pH和表面活性劑不同的試劑，測定結果可能差異明顯。（2）樣品異常成分干擾：有的試驗項目需要用工具酶將內源性代謝產物耗盡，比如丙氨酸氨基轉移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶（LDH）。如果使用單試劑，正常血清樣品延遲時間60秒即可；但當內源性酮酸增多（如酮癥酸中毒）時，試劑內LDH常常不能在60秒內完全將其清除，剩余酮酸會進入監測期干擾測定，使測定結

37、果偏高，所以延遲時間應增至90120秒。采用雙試劑，則可在加入R1后即進入預孵育期。 （3）方法學要求：比如肌酐（Jaffe氏法）測定的特異性不強，一般認為反應前20秒左右為乙酰乙酸等快反應干擾物呈色，后約80100秒為蛋白質等慢反應假肌酐呈色，2060秒肌酐呈色反應占主導地位。采用兩點法或速率法可減少干擾，但具體取多長的延遲時間，應根據試劑和儀器讀數特點來評價決定。 3工作程序要在保證準確性的前提下，合理設置參數，提高工作效率。最突出的例子是半自動生化儀上酶活性連續監測法的延遲時間設定。由于只能單份樣品逐一測定，若延遲時間全部設置在儀器內，每個延遲時間加監測時間至少1分鐘以上，守候時間較長。

38、工作量大時，可以根據儀器控溫、加樣及讀數和試劑特點以及室溫情況，將延遲時間挪一部分到機外，套式操作，但要確保機內延遲時間未需進入線性反應期。4要兼顧延遲時間和監測時間反應時間是有限制的。在速率法和兩點法中，延長延遲時間必然縮短線性監測期，減小測定的線性范圍，也易發生底物耗盡。 （三）樣品量、試劑量與稀釋量 有關參數包括樣品量、試劑量、稀釋（水）量、最小反應體積和最大比色杯容量等。如 HITACHI 7170反應體積 180 380l，最大體積 570l。 BT224半自動生化儀流動比色池容積33l，吸液量200990l，最適體積500l。1 最小反應體積在儀器光度讀數要用于結果計算時，反應液液面高度不低于光度計光徑的最小體積。它保證