1、南方醫(yī)科大學-血清分離和提純-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室南方雇耕大學生物化學實驗報告姓 名:學 號專業(yè)年級生物化學及分子生物學實驗教學中心6 / 14實驗名稱血清清蛋白、丫-球蛋白的分離純化及定量實驗日期2016年11月17日 實驗地點 第7實驗室指導(dǎo)老師尹紅評分教師簽名批改日期一、實驗?zāi)康?.掌握凝膠層析法、鹽析法、離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法；掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基礎(chǔ)方法；3. 了解柱層析技術(shù)的原理和相應(yīng)操作二、實驗原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。本實驗利用鹽析方法將血清中的清蛋白和球蛋白分離，并用電泳技 術(shù)觀察蛋白質(zhì)分離1 .鹽析蛋

2、白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因為有兩個穩(wěn)定因素即表面的電 荷和水化膜。當維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時，蛋白質(zhì)分子可相互聚 集沉淀而析出，蛋白質(zhì)分子沉淀析出的方法很多，根據(jù)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定 因素破壞的不同有中性鹽析法、有機溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物 堿試劑法等。鹽析法的原理是：中性鹽如硫酸鏤（NHJ2SOJ等對蛋白 質(zhì)作用破壞了蛋白質(zhì)表面水化膜，并且中和了部分電荷，從而使蛋白 質(zhì)相互聚集而析出。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電 荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同，因此調(diào)節(jié)鹽 的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達到分離的目的。血清球蛋白在半 飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而血清清蛋白在完全

3、飽和狀態(tài)下沉淀，利用此 特性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來，即在半飽和的中，血清蛋白不沉淀， 而血球蛋白沉淀，離心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸 鐳水即可溶解，由此達到分離清蛋白和白蛋白的目的。2 .脫鹽鹽析得到的蛋白質(zhì)含有高濃度中性鹽，需要有脫鹽過程去除蛋白質(zhì) 遺留的中性鹽常用方法有：透析法脫鹽和凝膠層析法脫鹽。本實驗采用凝膠層析法 脫鹽，在葡聚糖凝膠柱中，蛋白質(zhì)及鹽的分子量不同，當樣品通過層 析柱時，分子量較大的蛋白質(zhì)因為不能通過網(wǎng)孔而進入凝膠顆粒，沿 著凝膠顆粒間的間隙流動，所以流程較短，向前移動速度較快，最先 流出層析柱；反之，鹽的分子量較小，可通過網(wǎng)孔而進入凝膠顆粒， 所以流程長，

4、向前移動速度較慢，流出層析柱的時間較后。分段收集 蛋白質(zhì)洗脫液，即可得到脫鹽的蛋白質(zhì)。3 .純化（離子交換層析）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進行可逆的的交換過 程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負電荷的交換劑稱為陽 離子交換劑。本實驗采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負電荷 的離子可及其進行交換結(jié)合，帶正電荷的點正電荷的離子則不能，這 樣便可達到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點的不同可 進行分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pl各不相同，因此，在同一醋酸鏤緩 沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過DEAE離子交換層析將血 清清蛋白和伽馬

5、球蛋白分離出來。4 .純度鑒定（電泳）血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于PH7.4。它們在 PH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血漿 中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維 素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白 （Albumin） a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B-球蛋白、丫-球蛋白5條 區(qū)帶。三、材料及方法：（一）材料人血清試劑飽和硫酸核溶液0. 02mol/l pH值為6. 5的醋酸鏤緩沖液0. 06mol/l的PH值為6. 5醋酸鏤緩沖液南方醫(yī)科大學-血清分離和提純-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室0. 3mol/l的

6、PH值為6. 5醋酸鏤緩沖液1. 5mol/l 的 NaCl-0. Smol/NHAc 溶液20%磺基水楊酸l%BaC1溶液儀器和器材二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱和葡聚糖凝膠 G-25(Sephadex G-25)層析柱燒杯、1ml和10ml的吸管、滴管、試管、 黑色反應(yīng)板、鐵固定架、螺旋夾電泳槽和電泳儀除去鹽離子后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱 （lcmX6cm）用 3 毫升 0.02mol/l pH=6.5、 的醋酸鐵緩沖液洗脫，流出液量2毫升,用 3 毫升 0.02mol/l pH=6.5、 的醋酸鉉緩沖液洗月感 流出液量2毫升收集含有蛋白的洗脫液每、 管10滴，

7、連續(xù)收集三管DEAE-纖維素柱不用再生，可直1”除去鹽離子后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（IcmX 6cm）用1毫升0.06mol/l醋酸鏤緩沖 液（2毫升）洗脫，流出液量2 毫升（用5毫升0.06mol/l醋酸核緩沖 液流洗，除掉a球蛋白、B球蛋6 / 14 1）（南方醫(yī)科大學-血清分離和提純-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室步驟操作現(xiàn)象(1)鹽析取離心管一個，加入0. 8mol人或動物血清， 邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸鍍?nèi)芤?. 8ml,混勻 后室溫下放置lOmin ,離心lOmin (4000r/min) o用滴管小心吸出上清液置于試管中，作為純化清蛋白之用溶液由淡黃 色透明狀轉(zhuǎn) 變

8、為白色濁 液，離心后 溶液分層， 上層澄清， 下層為白色 沉淀(2)溶向離心管的沉淀加入0. 6mol蒸鐳水，振搖使白色沉淀完解沉淀之溶解，作為純化y球蛋白用全溶解，液 面有泡沫產(chǎn) 生步驟操作現(xiàn)象(1)調(diào)節(jié)層析 柱液面葡萄糖凝膠G-25層析柱經(jīng)0. 02mol/L .PH6. 5 NH4AC緩沖液流洗平衡后，取下恒壓 儲液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層 析柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床液面液體緩慢低 落，約每三 秒鐘兩滴(2)加樣品用細長滴管吸取上述經(jīng)鹽析所得的粗制蛋白 質(zhì)溶液，小心而緩慢的加入凝膠床上面，柱 下端用10ml刻度離心管接液，擰松柱下螺旋 夾，調(diào)節(jié)適當流速，使樣品進入凝膠床，

9、至 液面降到凝膠床表面為止3 )洗層析柱小心用 0. 02mol/L> pH6. 5 NH4AC 緩沖液 洗滌層析柱內(nèi)壁，以洗滌粘在柱壁上的蛋白 質(zhì)樣品液(4)洗脫待樣品液進入凝膠床內(nèi)，繼續(xù)用0. 02U1O1/L、PH6.5 NH4AC緩沖液流洗，同時注意流出液11(5)檢測及收在黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)加2滴0. 92mol/L磺 基水楊酸，隨時檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)，磺基水楊酸在接受層析集蛋白質(zhì)滴流出液1滴黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)接觸到磺 基水楊酸溶液，若出先白色混濁或沉淀，表 示已有蛋白質(zhì)流出(當凝膠床體積為5. 5ml 時，流出的液體量約為2ml就可能有蛋白質(zhì) 流出)，立即收集流出的蛋白質(zhì)溶

10、液。收 集約12滴后，滴流出液1滴于預(yù)先加有1滴 0. 05mol/L(l%)BaC12的黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi), 一旦見出現(xiàn)白色沉淀(表示有S042-),立即 停止收集收集的蛋白質(zhì)溶液即可分別過 DEAE纖維素柱，進行離子交換層析柱低落液前 兩次顯現(xiàn)澄 清，第三次 產(chǎn)生白色沉 淀，黑色板 孔氯化鋼部 分第一次即 出現(xiàn)白色沉 淀(6)層析柱再生平衡收集蛋白質(zhì)溶液后的凝膠層析柱繼續(xù)用 0. 02mol/L pH6. 5 NH4AC 緩沖液流洗，用 BaC12液檢測層析柱流出液，當流出液用 BaC12檢查S042-為陰性后,繼續(xù)洗滌2、31nL 凝膠層析柱即可再生平衡，可再次使用氯化領(lǐng)部分 在連續(xù)接受

11、幾次滴入后 沉淀顏色變 淡，直至完 全無沉淀 球蛋白的純化：過DEAE纖維素陰離子交換層析柱步驟操作現(xiàn)象(1)調(diào) 節(jié)層析 柱換沖 液面經(jīng)處理再生好的DEAE纖維素層析柱，取下其恒 壓儲液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夾，使柱 上緩沖液面剛好下降到纖維素床表面。柱下端 用10ml刻度離心管收集液體，以便了解加樣后 液體的流出量。2）加樣ini將除除鹽后收集的球蛋白溶液緩慢加到纖維 素柱上，調(diào)節(jié)層析柱下端的螺旋夾使樣品進入 纖維素柱床，至液面降到纖維素柱床表面為 止。(3)洗層析柱小心用1ml 0. 02mol/L PH 6. 5的醋酸鏤緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質(zhì)樣儲液。(4)洗脫待樣品進入纖維素柱

12、床內(nèi)，繼續(xù)用0. 02mol/L PH 6. 5的醋酸鏤緩沖液流洗，同時注意流出液量(5)檢 測及收 集蛋白 質(zhì)流洗時，隨時用0. 92mol/L磺基水楊酸檢查 流出液中是否含蛋白質(zhì)(方法同前)當有蛋白 質(zhì)出現(xiàn)時，立即連續(xù)收集三管，每管10滴，此 不被DEAE纖維素吸附的蛋白質(zhì)即為純化的丫- 球蛋白，取其中蛋白質(zhì)濃度最高的一管留作鑒 定用?，F(xiàn)象同前注意：a.當層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時, 不要使液面低于纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加13 / 14南方醫(yī)科大學-血清分離和提純-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室 樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖

13、維素沖起或破壞纖 維素床表面平整。C.切勿將檢測蛋白質(zhì)的磺基水楊酸及檢查硫酸根的 氯化鋼混淆，因為二者相應(yīng)生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應(yīng)注意 及時收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失。e.葡萄糖凝膠價錢昂貴， 要回收再生避免損耗，嚴禁倒掉。步驟操作準備電泳槽準備：將電泳槽置于水平平臺上， 兩側(cè)注入等量的巴比妥緩沖溶液，使其在 同一水平a,頁面及支架距離2、2. 5cm,用 三層濾紙或雙層紗布搭橋薄膜準備將醋酸纖維薄膜裁成2cm乘以8cm大小共 四段，在薄膜一段1. 5cm處用鉛筆輕輕畫 上一條橫線為點樣線，末端用鉛筆做記號。 進入巴比妥溶液中直至浸潤完全。用鑲子 青青取出，粗面朝上，平放在兩層

14、干濾紙 中間，輕輕拭去多余的緩沖液。醋酸纖維膜有 光面和粗面兩 面，粗面呈現(xiàn)啞 光樣，在此面做 標記點樣薄膜片置于干凈的玻璃或濾紙片上，粗 面朝上，用玻片或載玻片一段的截面在盛 有樣品的直接沾取2“3微升待測品，讓后 將樣品及薄膜點樣先輕輕接觸，均勻分布 在點樣線上，帶樣品滲入薄膜后移開，四 種樣品分別點樣。接觸后無明顯現(xiàn)象電泳將已點好的樣品薄膜放在鋪有濾紙鹽橋的14 / 14南方醫(yī)科大學-血清分離和提純-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室電泳槽上，點樣面朝下，點樣端至陰極， 輕輕拉平薄膜。平衡約5min,使緩沖液滲 透大道平衡。接好電路，調(diào)節(jié)電壓開始電 泳。待各個樣品沒有變化停止電泳，并輕 輕

15、取出。染色漂洗和鑒將染色液倒入大培養(yǎng)皿中，電泳完畢后用 鏡子取出薄膜，直接浸入染色約5min。后 將薄膜取出，漂洗至背景無色，觀察電泳 情況醋酸纖維膜洗 脫后表面呈現(xiàn) 出藍色條帶，條 帶樣見下文實驗過程中的現(xiàn)象已于上各表中列出 四、結(jié)果及討論：實驗結(jié)果如圖所示：A根據(jù)相同類型蛋白質(zhì)有相同電泳距離的規(guī)律，本組判定：圖中B組為 人血清的電泳結(jié)果，A, C, D三組及B組比較判定：圖中從左至右分別為丫-球蛋白、血清樣本、清蛋白2和清蛋白1的電 泳結(jié)果。對結(jié)果的討論：1、圖中可以看出清蛋白2的電泳調(diào)到在最深色條帶之前有少不明顯的 染色區(qū)段，該現(xiàn)象的原因可能為該條帶的點樣為首次分理出的清蛋白 還含有少數(shù)

16、球蛋白，故在電泳時停留在這些區(qū)段而顯色。2、圖中清蛋白1及血清樣的條帶有些許彎曲，該現(xiàn)象可能是由于點樣 是點樣用蓋玻片邊緣寬度過寬導(dǎo)致邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。還可能由于點樣 過多導(dǎo)致點樣區(qū)不均勻造成。3、有某些組的顯色結(jié)果不明顯或不顯色，這可能是由于點樣過少造成。思考題：1 .硫酸鍍鹽析一步,為什么是0. 8ml血清加0. 8ml飽和硫酸銹？半飽和狀態(tài)下的血清球蛋白在硫酸鐵溶液中將沉淀，血清清蛋白在不 飽和的硫酸鍍?nèi)芤褐腥芙猓瑢⒀搴惋柡土蛩徼F等體積混合后，配出 半飽和的硫酸鐵溶液，在此狀態(tài)下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，16 / 14南方醫(yī)科大學-血清分離和提純-2015級臨床醫(yī)學二-第7實驗室 因而可以將其分開。2 .為什么實驗中DEAE纖維素柱分離丫-球蛋白后不用再生，可直接用 于純化清蛋白？答：丫-球蛋白為帶正電荷蛋白，故不在DEAE中結(jié)合而直接從層析柱 中洗脫出來，造成兩種蛋白的流出速度不同所以分離丫-球蛋白后可直 接用于純化清蛋白。3 .應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳鑒