1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文 屮文摘要 兔出血癥（rabbi t hemorrhagi c d i s e a s e , rhd）是由兔出血癥病毒（r h d v）引起的兔的急性高度 接觸性傳染病，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為了在生產(chǎn)中防制該病，有必要對 毒株進(jìn)行分離鑒定及其特性研究，以及建立一種靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法.本研究從 兔病料中分離鑒定岀了3株有不同血凝性的兔出血癥病毒，分別命名為p 3_i d vi h n- 1 , 2 , 3 ,毒株經(jīng)兔體傳至3代后，能引起rhdv抗體為陰性的家 兔發(fā)病及死亡呈現(xiàn)穩(wěn)定的規(guī)律性.其中一 h n . 2株血凝效價為1 ： 6 4 0 ,曲f r 1 , 3

2、的血凝效價僅分別為1 ： 5, 1 : 1 0 ,但瓊擴(kuò)實驗及對流免疫電泳均能 看到清晰的沉淀線，電鏡負(fù)染可見大量球形，核心密度不同、大小約3 0 hm的病 毒粒子.根據(jù)g e n b a n k中的舶v的全基因序列，設(shè)計1對長為2 9 b p的引 物，在兩引物的5,端加入e c o r i和x b a i酶切位點(diǎn)，對兔出血癥病毒v p 6 0基因進(jìn)行rt pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增出約1. 7 k b的衣殼蛋白vp6 0基因的完 整片段，將其插入克隆載體p md 1 8 t上，構(gòu)建重組質(zhì)粒p mh p 6 0-1, 2, 3,對重組質(zhì)粒的測序顯示，v p 6 0基因全長1 7 4 0 b p ,共編碼

3、5 7 9 個氨基酸，并在g e n b a n k中注冊（發(fā)錄號分別為d q 0 6 9 2 8 0 , d q 0 692810 dq069282 ）將3株跚d v及卅界上其它rhd v,以及r c v, ebhs v的vp 6 0基因序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示一 h r r 1與w h n 2同源性為96. 1%, w h r r 1與whn 3同源性為9 6 . 5 %, w h n-2與whn 3同源性為9 9 . 4 %,比對序列中所有rhdv與rcv的 同源性為8 4 . 7 % 8 6 . 4 %，與e b h s v的同源性為6 9 . 0 % 7 0 . 5 %, 而p

4、3 1 d v各毒株z間同源性為8 9 . 7 5 3 9. 4 %,表明vp6 0是一個 很保守片段.在遺傳迓化上，世界各地的rhdv毒株在核昔酸水平上趨向4個支 譜系，在氨基酸水平上趨向3個支譜系，譜系問沒有明顯的地理或時i聞特征，r hdv i h n-1 , 2 , 3株分布在2個不同的譜系中，與咖v為同一屬的e b h sv和rc 1分別組成兩支不同的譜系，以上結(jié)果對認(rèn)識rhily的變異趨勢具有 參考價值。利用軟件分析了分離毒株的分子量，疏水性、抗原性、表面可能性、密 碼子偏愛性和二級結(jié)構(gòu)等分子結(jié)構(gòu)特征，并推測可能與其血凝性最相關(guān)的氨基酸位 點(diǎn)為p 2區(qū)的第3 0 4、3 0 5位，

5、及e區(qū)的第4 3 2位；其次是f區(qū)的第4 8 0、 5 0 8位該分析結(jié)論在國內(nèi)外未見系統(tǒng)報道，為rhdv的分子生物學(xué)增添了新 的資料.根據(jù)g e n b a n k中的衣殼蛋白vp 6 0基因內(nèi)的保守序列，用p r i m e r 5 . 0設(shè)計出1對可擴(kuò)增出vp 6 0基因內(nèi)部約4 9 6 b p的部分片段的引 物，建立了檢測rhdv的rt pcr方法，并采用該r t-p c r方法對人工 致死家兔體內(nèi)的r h d v i差t y t檢測；該方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈做度高, 檢測rhdv的r n a的靈敏度可達(dá)2 . 1 5 u s / m 1 本研究建立的優(yōu)于臥的靈 敏度高、特異性好的

6、rt-pcr方法及其p, hdv抗原檢測結(jié)果在國內(nèi)未見報 道本研究分離鑒定出冇不同血凝性兔出癥病毒株，并對英衣殼蛋ovp 6 0基因 進(jìn)行了克隆和相應(yīng)生物信息學(xué)分析，建，ot檢測rhd v的rt pcr方法， 為r h d v的地方毒株的分子牛物學(xué)及其結(jié)構(gòu)特征增添了新的資料，并為牛產(chǎn)中r ii dv的檢測提供了科學(xué)依據(jù)和一種靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法.關(guān)鍵詞：兔出血癥病 毒；衣殼蛋白；vp 6 0基因；序列分析；rt-pcr檢測ii四川農(nóng)業(yè)人學(xué)碩士 論文 the 1 s o h f i o n and identification andthe cloning o f caps id protein

7、 v p 6 0 gene o f r h d v st r a i ns and r t p c r detect i on fo r r h d v tian lagcprevent i ve veterinary m e d i c i n e ) d i r e c ted b y pro£wang h o n g n i n g abstract：. rabbit hemorrhagic disease (ibd), which i s caused b y rabbi t hemo r r h a g i c disease v i r u s ( r )田)v). i

8、s a rat 蛔"oom e , 白 tai and contagious di s e a s e and c a 1 1 oo s a 1 o h n o u ¥ economy loss i n rabbi t 自皿她 t o c o n t r o 1 the di 鬻 as 島 it，s n oo 覷略 ary t o i s o 1 a t e and i d _ a 俯匆 the virus 蟲曲肌 and study their molecular 蟲 |h| met i i 地 cha r a c t e r i s t i cs,越 we 1 1 越

9、develop a sensitive andaccuratedete c 血喀 m d枷 f orrhdv. i n this research, three s trains o f r h d v were isolated and i d e n t i f i e d from clicinal materials, which wer e named r h d v 呻融 n. 1, 2 9 3 . n e r h d v strains d i s p 1 a y e d stable pathogenic ity after 3 passages i n vivo. the 礎(chǔ)

10、 m)b n 2 shows hi . g h hemagglutinin valence o f 1 : 6 4 0, b u t w h n i and w h n 3 show 1 o w hemagglufininv a1 e n c e o f1：5,i：10 r esp e c t i v e 1y . l i mpi dp r e c i p i ta t i o nma n i fes t c oo b e s;e e n dur in g i d e n t if i c a ti on o f3 礎(chǔ) m i v isola t i0n sb y agp a nd c o u

11、 ni te r c tmlent i mm un o e 1 ect ro p h o r e s i s，勰 w e 11v i r1o n with ad i a m ete ro f about3 0 n m 啪b eo b ser v e d i nthe e 1ec tr o n micros cope.us i nga p a i f of 2 1 b p1x ei m e r¥to鋤 p1 i鳥49 6b p fra g m e n t si t u a t1n gthe interi o r ofconser v e d rhdv caps1d pr o t e i

12、 n v p'6 0 g en es e que n c e , t he r t-p crm et h o d w a s se t u p to te s tth e曲咖i c d is t r i but io n o f rhdvrna i nk i1 1 edb y rhdv-w h n 21mme d i a t e 1 yafter*q 土甘m i五ng懿p e蛔c on d i t i0n s .,m s p e 商 c di f f e re nt s ampies o frabbi tsf ia g m e n t a bout 50 0b p1 :n length

13、couldbe am p 1 i f i e db y t hi smethod.l 1 地 r t - p c r met ho d i s speci f i c ,r ap i dan d s e n s it i v e rat ei s 2 15 n g .j n i o trhd vte m p 1 a t ec d n a , the re f o r e , t h is metho 、d i sus e f u 1 f or c 1 i n1c di a g jiil o s e an d m o1 ec u 1ar q d i d e mi o 1 o g yinvest

14、igat ion o f r h d v . furthermore, 11 峙1 蟲 llll'd c 1 eo f rhdv whn 1'2,3 swains w懿a出刪from liver samplesof rabbits. the c a p s i d pr o t( e i n v p 60gene o f 3 strains w e t o c1 o ne dinto p m d18 t vector b y r餓 r and s eq u en c e& vp60 gene o f w h n 1 , 2,3 st rains werei nsize

15、o f17 4 0 n t and encoding 579 缸respectively, the 3 sequences were m b m i t t e d t o g e n b a n k with the accession numbe £. dq0692809dq069281o dq069282.r c v and e b h s vth other 1 d 他 g i s tel r e g a rd tn d w h n 21v p 6d i no f rh d v, s o 1 a t e s in5 alignment w i 0 gene sequences

16、g e n b a n k showed1the w o r that, w i t o t i d e sequence, wi re 1 h e 96. l%homo 1 ogy, w h n the 96. 5%homo 1 ogy,whn e the 99. 4%homo 1 ogy. aln u chares h a rai2 and w h n 3 s h a1 theand w h n 31 7 r h d v s 血一ainscincluding w h n 1 , 2 , the 8 4. 7 % 8 6 . 4%nuc 1 eot3 ) and r c v shareems

17、e1 v es sharet heh i g:hho m o1ogy0f897 % 9 9 4 % f o r nu c1eoti des equ e n ce5 0vp60gento f rhdvw asa ra the rco n s erve dgeneforthe phy1 0ge n et ict ree o a 1 1th erhdvs1矗ii is 慨 d to 4gene a1o g ies 0 11th e10vdo fnuclcoti des , wh ik3 gen e a 10g:i es011th elevel o fa1n m oa c1d s .t h e re腫

18、n otn0f1c e ab m phys ic a1a nd tem p0r a重char acter1s t ic , such asiuii)vowh n -1'2 , 3str a1nss1t u at e 2 d i ff erentgen e a1ogiest he0ther two m e m b er s0f啦0 v im s ofcalic1v iri d e homo 1 ogy, and share the 6 9 . 0 %5 7 0 . 5 % am i n o 礎(chǔ) hom0 109y,b ut the r h d v io 1 a t e st hi d a

19、 e family,rev and e b h s v, p a r a 1 lei t o rh d v and form 2 different genealogies b o t h oil thelevel o f nucleotides andiii四川農(nóng)業(yè)大學(xué)硬士論文鋤i oo a d ds .the a n a 1 yt i cr e s 11 1t sabovea oo u se f u1 forrecogn 逝 the v ar i a tion t e n de n c y of足日 d 驢the fol lowingmolecu1 a r structure charac

20、teristic o f r h d v w) m 1 . 2 , 3 suab 夠， molecular mass, i s o e 1 e c仃 ic pcdlltjhyd rophob i c i ty, t ransmemb ranehe11c e s ,h ydr0p h i 1 i c it y,f1ex i b1 e 他一g10nsam i g en ic1ty ,飄響oo p r0 ba b11i t y ,dx1 0 inb1as2 d- st ructu r e a oo a na 1y zed1 n n1h.n gb101nfo r m af icss o f t w a

21、 re ,a n <dth e am1n oac1dsi t e 1°c 1at1n g t o h蜘明gg 1曬iifii.w e r <su p :p (3sedt o磯嗎n g304,305,432 ,4 8095 0 8the resu1tscomp ose0f new s up p1 emen t f0rt hem01ec u 1 arb10logy i n fo rm ad0n o frhd v.keywords：rh d v；caps i dp ro te1n ； v p60g enes sequence analysis； r t-p c r i v 論文

22、獨(dú)創(chuàng)性聲明本 人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。 盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文屮不包含其他個人或 集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu) 的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己 在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：1薊多良 於年鉗；才日關(guān) 于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī) 定，b|j：學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許 論文被杳閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編

23、學(xué)位論文。 同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分 內(nèi)容。研究生簽需：1薊 淀 知£年陽多6|_1如淵萼導(dǎo)師酶妙達(dá) 四川農(nóng)業(yè)大 學(xué)碩士論文1 前言1 . 1兔出血癥概述 兔出血癥(rabbit hemo r r h a g i c disease ,r hd)是由兔出血癥病毒(r h d v)引起的兔的 種急性毫度接觸性傳染病，以呼吸系統(tǒng)出血、實質(zhì)器官水腫、淤血及出血變化為 特征，該病傳播快，發(fā)病急，發(fā)病率和死亡率極高.該病于1 9 8 4年首先在我國 江蘇等地暴發(fā)，隨即蔓延到全國多數(shù)地區(qū)，國內(nèi)學(xué)者命名為兔出血癥(船)，俗稱。 兔瘟0 1 9 8 6

24、年來，意人利、法國，蘇聯(lián)、西班牙和徳國等國家相繼暴發(fā) 該病，現(xiàn)加v已波及亞洲，歐洲、北美洲和非洲的四十多個國家，伽咖唧嘲刪1嘲淵 口町，是養(yǎng)兔業(yè)的嚴(yán)重威脅.1 9 8 8年布達(dá)佩斯兔科學(xué)會議對該病迸行了專題討 論，并建議統(tǒng)一采用我國的命名；1 9 8 9年，國際獸疫局(0 i e)將該病列入“國 際動物保健編冃"b類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部9 6號令頒布為二類疫病.對rhd v 的分類，曾一度爭論，將其列入小rn a病毒(picornavirus)、細(xì) 小病毒(parvovi r u s )訂hi或和類細(xì)小病毒(parvori r u s 1 i k e agent) oo和嵌杯病毒(ca

25、li civirus)洲刪嘲等.隨著 對病毒形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識的深入，1 9 9 5年國際病毒分類委員會(i c t v)在第6次分類報告中正式確立了 rhdv在病毒學(xué)中的分類地位，將其歸 類于嵌杯病毒科(caliciviridae), 2000年(第7次報告)乂 進(jìn)一步列為恢杯病毒科兔病毒屬(lagovi r u s ),屬于同一屬的病毒還有 歐洲棕色野兔綜合征病毒(髓 i s v)刪咖嘲刪，以及新近報道的兔嵌杯狀病毒(rcv )嘲叫.兔出血癥病毒在氯化錐中的浮密度為1291. 3 4 9 /c m 3 ,沉降系數(shù)為8 51 6 2 s .對乙醸、氯仿有抵抗力嘲；能夠耐受5 0 &#

26、176;c 6 0 r a i n , p h 3 03 0 r a i n , 2 % n a 0 h 3 0 r a i n , 3 %福爾形林6 0 r a i n的處理，對胰蛋白酶不敏感；對12 9沖醛作用2 5小時。 1 0 %漂白粉作用23小時。2 %戊二醛作用1小時或1地氧化鈉作用3 . 5小 時均可以滅活病毒.現(xiàn)有研究結(jié)果表明，世界范圍內(nèi)的所有病毒分離株似乎屬于同 一血清型陽“1,無論是遺傳特性還是抗原性都極其穩(wěn)定，借助現(xiàn)有實驗手段尚不 能將不同地區(qū)的分離株區(qū)分開來.rhdv像人類的杯狀病毒一樣，難于進(jìn)行細(xì)胞 培養(yǎng)，至今尚未真正找到一種能使其長期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞。人工感染初生和成

27、年大 鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠等實驗動物，均不發(fā)病，也不能在雞胚上增殖.吉傳義嘲等（19 9 1）偶然獲得一株轉(zhuǎn)化的乳兔腎上皮型細(xì)胞（d j r k）是唯一的rh i ） v在傳代細(xì)胞上分離培養(yǎng)成功的報道.。為控制該病，國內(nèi)外獸醫(yī)工作者已研制 出多種常規(guī)疫苗，如兔瘟組織滅活苗，、四川寢業(yè)人學(xué)碩士論文兔瘟油翼劑滅活苗 嘲、兔瘟氮氧化鋁佐劑苗、兔瘟蜂膠佐劑滅活茁咖、熱滅活疫苗等.隨著分子生物 學(xué)的發(fā)展，國外學(xué)者止致力于采用rhdv的唯一結(jié)構(gòu)蛋白基因（vp6 0）開發(fā) 多種基因工程疫苗，如大腸桿菌表達(dá)亞單位疫苗刪、昆蟲細(xì)胞表達(dá)亞單位疫苗刪咖, 酵母細(xì)胞表達(dá)亞單位疫苗嘲咖，馬鈴萼表達(dá)的亞單位疫苗嘲刪咖等基

28、因工程亞單位 疫苗，以及重組牛痘病毒嘲、金絲雀痘病毒嘲、黏液瘤病毒m 1刪嘲咖等活載體苗雖 然現(xiàn)已在i玨q d v的基因工程亞單位疫苗及重組活載體疫苗方面取得很大的進(jìn) 展，但這些疫苗大都實驗室研究或出間實驗階段，與生產(chǎn)i：的實際的廣泛應(yīng)用還有 一定茨離，現(xiàn)在兔出血癥的預(yù)防還是主要靠常規(guī)疫苗的免疫。1 2兔出血癥病毒 的病原特性和分了生物學(xué)研究進(jìn)展12. 1形態(tài)結(jié)構(gòu)p, t dy病毒粒了呈 球形，無曩膜，衣殼為二十面體對稱嘛''嘲，表面呈嵌杯樣，電鏡觀察碰一i d y病 毒粒子的直徑為3 24 2 n m,病毒衣殼由3 2個高56 n m的圓柱狀殼粒構(gòu) 成，核心直徑為1 ?2 3

29、 nm,電鏡下述可見少數(shù)沒有核心的病毒空衣殼.鄭東 等嘲利用低溫電子顯微術(shù)和計算機(jī)像重構(gòu)技術(shù)詳細(xì)研究了1疆一idv的三維結(jié) 構(gòu)，發(fā)現(xiàn)rhdv三維結(jié)構(gòu)顯示了杯狀病毒的典型結(jié)構(gòu)特征.高分辨率的重組no r w a 1 k病毒衣殼蛋白在殼層區(qū)折疊為b桶狀結(jié)構(gòu).由于刪v衣殼殼層區(qū)的半 徑和厚度與重綁o r w a 1 k病毒衣殼比較相近，故推測咖噥殼蛋白在殼層區(qū)也折 疊為b-桶狀結(jié)構(gòu)，對r皿v衣殼蛋片vp6 0所進(jìn)行的二級預(yù)測表明表明該蛋自 在殼層區(qū)主耍折疊為量一結(jié)構(gòu)叨.低溫電子顯微術(shù)顯示r皿v有兩種不同核心密度 的病毒顆粒一高密度顆粒和低密度顆粒嘲.三維結(jié)構(gòu)顯示了 rhdv高密度顆粒和 低密度顆粒農(nóng)

30、殼結(jié)構(gòu)相同，均顯示了杯狀病毒的典型結(jié)構(gòu)特征，由于rhdv基因 組和亞基因組r na分別包裝于病毒衣殼內(nèi)，上述兩種顆粒分別對應(yīng)于含基因組和 含亞基因組的p, hd v病毒顆粒嘲.1.2.2病毒的血凝性r h d y能夠凝集 人的各型紅細(xì)胞，其中以對。a”型紅細(xì)胞凝集價最低嘲，對。0”型紅細(xì)胞凝集價 最耐“；對鵝、雞、綿羊紅細(xì)胞呈輕度凝集，對鴨、sm鳥、水牛，馬、狗、豚鼠和小 白鼠的紅細(xì)胞均不凝集；但是pj-i dv不能凝集人的臍帶或胎兒的紅細(xì)胞，故 推測人體的ri-mv受體與發(fā)育過程中出現(xiàn)的abh家族抗原有關(guān)嘲。rhdv 血凝活性可被氯胺一t、胰蛋白酶、硼氫化鈉破壞，但能夠抵抗氯仿、乙醸、過碘

31、酸鉀、受體破壞酶和甲醛的處理人紅細(xì)胞表面受體對脂溶劑敏感，而胰蛋白酶、 過碘酸鉀、受體破壞酶2四川表業(yè)大學(xué)硬上論文和硼氫化鈉不影響其活性嘲.但 近來有報道介紹個別毒株在不同溫度下其血凝性較常規(guī)毒株不同，如1 9 9 6年， 英國學(xué)者州分離出1株rhdv要在4c才有血凝性，同年，另有學(xué)者又分離出無血凝性的唧v毒株，其流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化、e l i s a及蛋白印記分 析與常規(guī)rhd v株相同。1 9 9 8年。意大剝學(xué)者分離報道了 1株與常規(guī)脯d v 毒株存在抗原差異的pj t dv分離株一rhdva，該毒株與能保護(hù)常規(guī)rhd v的單抗1h8不反應(yīng)，且與常規(guī)r曲v制各的多價血清反應(yīng)也較

32、弱，但應(yīng)用常規(guī) rhd疫苗仍能完全保護(hù)給毒株對免疫兔的攻擊.12. 3病毒基因組結(jié)構(gòu)rh d v基因組是首株被完全序列出的杯狀病毒基因組嘲.oo y的核酸為單鏈正義 rn a，全長7 4 3 7個核昔酸，5,末端沒有帽狀結(jié)構(gòu)，而是共價結(jié)合與感染性相 關(guān)的 vpg（vi r i o n prot e i n , genome 1 inked ）蛋片， 該蛋白的分子量為15 16kda,3，末端有p o 1 y a尾.第1 _9 n t為5， 一非編碼區(qū)，最后5 9 n t為3非編碼區(qū).咖惰兩個開放讀碼框（0 r f ）嘲， 第1 0 7044nt為5，末端的orf1,第7 025 7378為3，

33、末端的 短開放閱讀框orf 2,它與orf 1的3,端有1 9個核首酸重疊。除基因組rn a外，在感染的組織和病:毒顆粒中還有一個約24 k b的亞基因組1 i na,該 rn a包含了 vp 6 0蛋白的編碼區(qū)及orf 2 ,主要編碼v p 6 0嘲m.另外， 亞基因組rn a與基因組rn a的5，端都共價結(jié)合著一個1 , pg蛋白.rhd v基因組0 r f 1和o r f 2的長度分別為7 0 3 5 b p和354bporf1 編碼一個分子量2 5 6 kd的多聚蛋白。該多聚蛋白被酶解產(chǎn)生分子量為8 0、7 3, 6 0和4 3kb的4個主要多歇四，分別相應(yīng)于多聚蛋白的2 c樣解旋酶（

34、8 0 kd）, 一個保守區(qū)（4 3固）、3 c樣蛋白和3 d樣蛋白（7 3髓）以及衣殼 蛋白（6 0 kd）其中2 c樣蛋白是一種與rna復(fù)制有關(guān)的螺旋酶4 13 c樣蛋白具有胱氨酸蛋白酶活性，與病毒蛋白的翻譯后加t有關(guān)；3d樣蛋白是一種 rn a依賴的rn a聚合酶；衣殼蛋白vi嗨d是1謹(jǐn)玨）y唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，與抗 病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)。其屮對3 c樣蛋白研究較為詳細(xì)嘲叫，在大腸桿菌 表達(dá)的該酶可特異性的切割多聚蛋白，切割位點(diǎn)位于病毒衣殼蛋白和rna聚合酶 的連接處.利用體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，orf 1編碼6個非結(jié)構(gòu)蛋白（kn a螺旋酶（hel）,蛋白酶（pro）、rna依賴的r

35、na聚合酶（pol）、 pl6、p23、p30）、以及結(jié)構(gòu)蛋白v p 6 0和v pg。orf 2編碼一個 分子量為1 2 k d的蛋白結(jié)構(gòu)成分v p 1 0 ,該蛋白含量較v p 6 0要低，為堿性 蛋白，其功能可能是在病毒粒子中與病毒rn a結(jié)合.g r a n z o w, h.等口 釘通過對r h d v病毒楊d樣顆粒（core fikeparticle, c l p）研究，推測該c l p可能是基因組表達(dá)不完全和由斷裂的基因表達(dá)而來.3四 川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文12. 4病毒的衣殼蛋白v p 6 0杯狀病毒都只有一個 主要的結(jié)構(gòu)蛋白一農(nóng)殼蛋白vp6 0 , rhdv也是如此.杯狀病毒 衣

36、殼蛋白的氨 基酸序列分為 a （ b 2 1 ） , b（22 300） c（301 328）. d（3 29 343）、 e （344-434）. f （435-580）六個區(qū)域.電鏡 觀察rmv發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)蛋口折疊成兩個 主要的緊湊區(qū)域，內(nèi)殼（ss h e 1 1 區(qū)）由v p 6 0的n端組成。容納和保護(hù)基因組，包括a和b區(qū)；外殼（p2區(qū)） ftlvp 6 0的c端組成，包括c、d, e、f區(qū)，該端暴露在病毒表面，編碼病毒 的主耍抗原決定族.1998年，j. l mart i n e z 一torrecuad r a d a等發(fā)現(xiàn)了衣殼上的兩個主要抗原區(qū)分別位于vp6 0蛋白n端第3 1

37、.2 5 0位和c端第4 7 7 5 7 9位氨基酸z間.e. v i a p 1 a n a等咧發(fā)現(xiàn)vp 6 0蛋白氨基酸（包括蛋白質(zhì)的前1 7 5個氨基酸）與抗血清反應(yīng)強(qiáng)度最 強(qiáng)，是其他區(qū)域（蛋白質(zhì)竣基端）的1 0 1 0 0倍，故推測vp6 0竣基端的抗 原結(jié)構(gòu)主要是依賴于構(gòu)象決定族的b細(xì)胞位點(diǎn)，而氨基端則是線性的抗原決定族, 在病毒感染和滅活疫苗的免疫中誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.r f 1 ） v的衣売由 1 8 0個拷貝的6 0 kd的多肽聚合而成，至今國外已有多個實驗室分別在昆蟲細(xì) 胞、植物和酵母中成功表達(dá)了可h發(fā)聚合成病毒樣顆粒（v h u s -l i k e p ar t i c

38、 1 e s , vi肌）的r b ） v的衣殼蛋白刪嘲嘲，v l p s不含有r n八、 而在物理形態(tài)和免疫原性上與完整的自然野毒株完全相同，這為疫苗研制和診斷提 供了原料.國內(nèi)在rhd v的基因工程疫 苗方面的研究才剛起步，劉懷然（2 0 0 2年），向華咖（ 2 0 0 4年），陳興祥ii叮（ 2 0 0 5年）分另f采用rt- p c r法克隆和測序了不同pj 1 dv毒株的vp6 0基因，不同毒株顯示了高度 同源性.嚴(yán)維巍潤，崔治中等n町（ 2 0 0 3年）將rhd v . wx 8 4株的vp 6 0基因分別克隆到表達(dá)性載體p g e川p 1、p e t 5 ,以及桿狀病壽和酵母

39、 中進(jìn)行表達(dá)，預(yù)期的蛋白均獲得到了高效 表達(dá).13兔出血癥病?炯鍛夥椒（1難 芯拷？兔出血癥傳播快，發(fā)病率和死亡率極高，臨床表現(xiàn)發(fā)病突然、尖叫、死亡急, 死前有神經(jīng)癥狀.病變特點(diǎn)是各組織器官彌漫性的點(diǎn)狀出血和實質(zhì)器官的淤血、水 腫和變性咖.根據(jù)臨床特點(diǎn)和病變特點(diǎn)可作出初步診斷，確診需經(jīng)實驗室檢查，可 通過檢測病死兔組織中的病毒或病毒抗原進(jìn)行確診.1.3. 1常規(guī)檢測方法1. 31電鏡檢杳：病兔的肝臟含毒爨較高，故其勻漿后經(jīng)粗提后作為診斷的 原始材料，經(jīng)負(fù)染后電鏡觀察可見大量典型的杯狀病毒粒了，直徑為3 2 - 3 5 n mw ao電鏡的直四川農(nóng)業(yè)人學(xué)碩士論文接觀察法還可通過pj q dv的特

40、異性 抗體或單克隆抗體誘導(dǎo)病毒粒子形成凝集塊便于觀察鑒定嘲哪咖咖.此外，出口的 兔肉勻漿凍融后用p e g濃縮5 0 - 1 0 0倍，離心取上清電鏡檢測是否帶 毒13. 1. 2血凝試驗和血凝抑制試驗“咖嘲s多數(shù)人習(xí)慣使用人的。0"型 紅細(xì)胞，據(jù)楊漢春等報道，使用人的不同血型新鮮紅細(xì)胞所得結(jié)果無明顯差異，亦 可將人的紅細(xì)胞通過高猛酸鉀i古i定后使用.辛盛鵬fi哪，鄭厚旌嘲，張再清咖等報 道使用用醛化紅細(xì)胞作臥，效果良好眥試驗簡便、快速、不需特殊儀器，在診斷 和免疫效杲測定屮廣泛應(yīng)用，但h a的缺點(diǎn)是，影響因素較多淵，且現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)有些 病毒分離株不產(chǎn)生血凝現(xiàn)象，徳國和意人利學(xué)者報道ha

41、有8 %的假陽性或假陰 性肛試驗的特異性及敏感性好，可用于流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果檢測，多采 用b法血凝抑制試驗術(shù)式；也可用于可疑病毒的血清學(xué)鑒定，此時多采用a術(shù) 式1. 3. 1. 3瓊脂擴(kuò)散試驗：矯止德，羅滿林咖等用病死兔肝臟乳劑制備的 凍融抗原對感染病毒的兔血清進(jìn)行木試驗，檢出了沉淀抗體.戴康等發(fā)現(xiàn)，以甲醛 滅活制備的抗原與抗血清反應(yīng)時，粗提抗原可出現(xiàn)2-3條沉淀帶，高度提純的抗 原則只出現(xiàn)i條帶。但木試驗要求病毒抗原提純濃度較高。3. 1. 4對流免 疫電泳：張洪英（ 2 0 0 0年）嘲用粗提病毒與抗血清作對流電泳，正極加病毒液, 負(fù)極加抗血清，電泳2 h后出現(xiàn)沉淀線，同時該法也用

42、于快速提純兔瘟病毒跚.此 外，國內(nèi)外學(xué)者還建立了多種檢測診斷方法，如熒光抗體染色嘲、酶標(biāo)抗體技術(shù)、 免疫金銀法染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）嘲釧九.13 . 2分子牛物 學(xué)檢測方法g u i t t r e等刪以5,末端衣殼蛋白基因為對彖設(shè)計了rt p cr方法，結(jié)果說明木法比elis a放感1 0 1倍，可以檢出少至12個拷貝的模板c dn a. 2 0 0 1年，g a 1 1 r e c u 1 e , g.等創(chuàng)建了免疫捕獲r t-p c r方法，先用抗rhdv高免血清包被elisa板，然后加入感染兔肝 懸液進(jìn)行捕獲，接著在el i sa孔中直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后在取出反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)

43、行常規(guī)p c r,本法比常規(guī)el i s a敏感1 0 1 0 0倍，適于大批量樣品的分 了流行病學(xué)調(diào)杳.2 0 0 2年，劉光耀，杜念興等嘲采用p c r-e l i sa方法 檢測rhdv在djrk細(xì)胞上的增殖規(guī)律，該法將pcr、液相雜交和elis a結(jié)合起來，在pcr擴(kuò)增反應(yīng)中加入地高辛，然后用特異性探針進(jìn)行液相雜交， 再加入標(biāo)有堿性磷酸酶的抗體和發(fā)光底物，通過測定顏色反應(yīng)，從而量化樣品中的 模板.,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文 另外，g e 1 me t t i , d.等嘲以d i g o x i g e n i n標(biāo)記的r n a探針建立了原位雜交技術(shù)檢 測組織中的r h d v分 布，肝細(xì)胞檢測為陽性，但脾臟檢測為陰性，這與以往報道不符。但k i mu r a , t.等同樣用非放射性的原位雜交技術(shù)同時在肝、脾和肺屮檢測到病毒核酸，且發(fā) 現(xiàn)巨噬細(xì)胞中也存在著病毒的復(fù)制。在上述多種檢測方法中，常規(guī)檢測方法可用于 檢測抗原、抗體及抗原分布等，操作簡單，不需要過于特殊的儀器設(shè)備，成木較低, 適合基層中的一般性檢測,但其檢測的靈敏性和特異性有限。分子生物學(xué)檢測方法, 尤其rt-p c r技術(shù)，是一種應(yīng)用很廣的病毒檢測技術(shù)，在疾病診斷中發(fā)揮著重 要作用，該方法具有診斷快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)