1、第五章第五章 蛋白質(zhì)提取純化、理化性質(zhì)蛋白質(zhì)提取純化、理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)測定分析與結(jié)構(gòu)測定本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：1.1.蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與分析方法；蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與分析方法；2.2.蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的一般步驟；蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的一般步驟；3.3.重組蛋白提取、純化與鑒定的注意事項(xiàng)；重組蛋白提取、純化與鑒定的注意事項(xiàng)；4.4.蛋白質(zhì)技術(shù)；蛋白質(zhì)技術(shù)；5.5.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定。第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與分析方法蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與分析方法一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)二、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)三、蛋白質(zhì)的紫外吸收三、蛋白質(zhì)的紫外

2、吸收四、蛋白質(zhì)的分子量四、蛋白質(zhì)的分子量五、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)五、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)六、蛋白質(zhì)的沉淀六、蛋白質(zhì)的沉淀七、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性七、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一ph值時，蛋白質(zhì)解離成正、值時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，凈電荷為負(fù)離子的趨勢相等，凈電荷為“o”，此時溶液的，此時溶液的ph值稱為該蛋白質(zhì)的值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point, pi)。由于。由于各種蛋白質(zhì)所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目不各種蛋白質(zhì)所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目不同，因而有各自的等電點(diǎn)。同，因而有各自的等電點(diǎn)。 蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)溶液的

3、ph大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。電荷，反之則帶正電荷。 蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)決定了它在電場中移蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)決定了它在電場中移動的方向。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不動的方向。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。移動。 人體體液中許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在人體體液中許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在ph5.0左右，左右，所以在體液中以負(fù)離子形式存在。所以在體液中以負(fù)離子形式存在。一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)二、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) (一一)茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reactio

4、n) -氨基酸與水化茚三酮氨基酸與水化茚三酮(苯丙環(huán)三酮戊烴苯丙環(huán)三酮戊烴)作用時，產(chǎn)生作用時，產(chǎn)生藍(lán)色藍(lán)色反應(yīng)。蛋白質(zhì)是由許多反應(yīng)。蛋白質(zhì)是由許多-氨基酸組成的，故也呈此顏色反應(yīng)。氨基酸組成的，故也呈此顏色反應(yīng)。 (二二)雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction) 蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色紫紅色，稱為雙縮脲，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個以上反應(yīng)。凡分子中含有兩個以上conh鍵的化合物，都呈此鍵的化合物，都呈此反應(yīng)。反應(yīng)。 (三三)米倫反應(yīng)米倫反應(yīng)(millon reaction) 蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試

5、劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液合液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)椋鞍踪|(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色紅色沉淀。沉淀。 此外，蛋白質(zhì)溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發(fā)此外，蛋白質(zhì)溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發(fā)生顏色反應(yīng)。生顏色反應(yīng)。 三、蛋白質(zhì)的紫外吸收三、蛋白質(zhì)的紫外吸收 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中含有因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中含有tyr、phe、trp等芳香氨基酸，其紫等芳香氨基酸，其紫外吸收最大峰的波長為外吸收最大峰的波長為280nm。而且光吸收值（。而且光吸收值（od值）與蛋值）與蛋白質(zhì)的濃度程正相關(guān)。白質(zhì)的濃度程正相關(guān)。 測定蛋白質(zhì)濃度的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和經(jīng)驗(yàn)公式法。測定

6、蛋白質(zhì)濃度的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和經(jīng)驗(yàn)公式法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法:經(jīng)驗(yàn)公式法：經(jīng)驗(yàn)公式法： 蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）= 1.45od280-0.74od260注意：注意：在使用該公式時，在使用該公式時，od280 應(yīng)在應(yīng)在0.10.7之間，所測值才之間，所測值才 比較準(zhǔn)確。比較準(zhǔn)確。四、蛋白質(zhì)的分子量四、蛋白質(zhì)的分子量 蛋白質(zhì)分子大小通常用道爾頓（蛋白質(zhì)分子大小通常用道爾頓（dalton，da）或千道爾頓）或千道爾頓（kda）表示，一般在）表示，一般在6103106之間。之間。 測定蛋白質(zhì)的分子量有許多方法，常用的有測定蛋白質(zhì)的分子量有許多方法，常用的有sds-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠

7、電泳（胺凝膠電泳（sds-page）、凝膠過濾法等。這些方法的誤差）、凝膠過濾法等。這些方法的誤差為為5%10%。dalton: a unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom. named after john dalton (17661844), who developed the atomic theory of matter.sds-page測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量蛋白質(zhì)洗脫體積與分子量的關(guān)系蛋白質(zhì)洗脫體積與分子量的關(guān)系分子篩層析示意圖分子篩層析示意圖 凝膠過濾法：凝膠過濾法： 又稱分子篩層析法又稱分子篩層

8、析法 將幾種已知分子量的蛋白質(zhì)混合溶液上柱洗脫，記錄各種蛋白質(zhì)的洗脫將幾種已知分子量的蛋白質(zhì)混合溶液上柱洗脫，記錄各種蛋白質(zhì)的洗脫體積。以分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。體積。以分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測蛋白質(zhì)溶液在上述相同的層析條件下分離，記錄其洗脫體積，然后待測蛋白質(zhì)溶液在上述相同的層析條件下分離，記錄其洗脫體積，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子量。 五、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)五、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 根據(jù)溶質(zhì)在溶劑中的顆粒大小（分散程度），可以把分散根據(jù)溶質(zhì)在溶劑中的顆粒大小（分散程度），可以把分散系統(tǒng)分為系統(tǒng)分為3類：類：

9、 分散相質(zhì)點(diǎn)小于分散相質(zhì)點(diǎn)小于1nm的為真溶液，大于的為真溶液，大于100nm的為懸濁液，的為懸濁液，介于介于l100nm的為膠體溶液。的為膠體溶液。 分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需具備分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需具備3個條件：個條件： 1）分散相質(zhì)點(diǎn)大小在）分散相質(zhì)點(diǎn)大小在l100nm范圍內(nèi)，這樣大小的質(zhì)點(diǎn)在范圍內(nèi)，這樣大小的質(zhì)點(diǎn)在動力學(xué)上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對這種質(zhì)點(diǎn)碰撞的合力不等于零，動力學(xué)上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對這種質(zhì)點(diǎn)碰撞的合力不等于零，使它能在介質(zhì)中不斷作使它能在介質(zhì)中不斷作布朗運(yùn)動布朗運(yùn)動（brown movement）；）； 2）分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有）分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷

10、，互相排斥同種電荷，互相排斥，不易聚集成，不易聚集成大顆粒而沉淀；大顆粒而沉淀； 3）分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成）分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層水化層（hydration mantle），質(zhì)點(diǎn)有了水化層，相互間不易靠），質(zhì)點(diǎn)有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。攏而聚集。 六、蛋白質(zhì)的沉淀六、蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)分子凝聚并從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)沉蛋白質(zhì)分子凝聚并從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)沉淀淀(precipitation)。 變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的

11、蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。 蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有三種穩(wěn)定因素：顆粒蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有三種穩(wěn)定因素：顆粒表面的水化層；電荷；布朗運(yùn)動。表面的水化層；電荷；布朗運(yùn)動。 除去前兩個穩(wěn)定因素除去前兩個穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液如調(diào)節(jié)溶液ph至等電點(diǎn)和加入脫水至等電點(diǎn)和加入脫水劑劑)，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。 (一一)鹽析鹽析(salting out) 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫穩(wěn)定性而使其析出，這種方法

12、稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。 (二二)重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽沉淀，沉淀的條件以沉淀，沉淀的條件以ph稍大于等電點(diǎn)為宜。因?yàn)榇藭r蛋白質(zhì)稍大于等電點(diǎn)為宜。因?yàn)榇藭r蛋白質(zhì)分子有較多的負(fù)離子，易與重金屬離子結(jié)合成鹽。分子有較多的負(fù)離子，易與重金屬離子結(jié)合成鹽。 (三三)生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)又可與生物堿試劑蛋白質(zhì)又可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某以及某些酸些酸(如三

13、氯醋酸、過氯酸、硝酸如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，沉結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，沉淀的條件應(yīng)當(dāng)是淀的條件應(yīng)當(dāng)是ph小于等電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電荷，易于小于等電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電荷，易于與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。常用的沉淀方法：常用的沉淀方法：(四四)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì) 可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點(diǎn)時使的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點(diǎn)時使蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下，有機(jī)

14、溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進(jìn)例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進(jìn)行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。(五五)加熱凝固加熱凝固 加熱蛋白質(zhì)溶液，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固加熱蛋白質(zhì)溶液，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固(coagulation)而而沉淀。沉淀。 加熱首先是使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被打開，加熱首先是使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被打開，呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對稱性增加，疏水基團(tuán)暴呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對稱性增加，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和

15、蛋露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。清都凝固。 七、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性七、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性變性（變性（denaturation）：）： 在變性因素的作用下，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，空在變性因素的作用下，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，空間構(gòu)象被破壞，生物學(xué)功能喪失，理化性質(zhì)也發(fā)生改變的現(xiàn)間構(gòu)象被破壞，生物學(xué)功能喪失，理化性質(zhì)也發(fā)生改變的現(xiàn)象象。 變性蛋白質(zhì)溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶性被破壞，易變性蛋白質(zhì)溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶性被破壞，易發(fā)生沉淀。發(fā)生沉淀。復(fù)性（復(fù)性（renaturation）: 在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)從伸展態(tài)恢復(fù)到折迭態(tài)，在一定條件下，變性的

16、蛋白質(zhì)從伸展態(tài)恢復(fù)到折迭態(tài)，并恢復(fù)其原來的理化性質(zhì)和生物活性。并恢復(fù)其原來的理化性質(zhì)和生物活性。 抗菌肽的提純；抗菌肽的提純；rnase a的配制的配制第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定提取、純化與鑒定 一般步驟一般步驟一、一、蛋白質(zhì)提取、純化的特點(diǎn)蛋白質(zhì)提取、純化的特點(diǎn)二、二、蛋白質(zhì)提取、純化前的準(zhǔn)備蛋白質(zhì)提取、純化前的準(zhǔn)備三、三、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟 與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)：主要特點(diǎn)： 生物材料的組成極其復(fù)雜。所以生物大分子的分離純化生物材料的組成極其復(fù)雜。所以生物

17、大分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標(biāo)方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標(biāo)準(zhǔn)方法是不可能的。準(zhǔn)方法是不可能的。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微。許多生物大分子在生物材料中的含量極微。 許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境極易失活。許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境極易失活。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、ph值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷，因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果常有很大的經(jīng)驗(yàn)成份，實(shí)驗(yàn)難準(zhǔn)確估

18、計(jì)和判斷，因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果常有很大的經(jīng)驗(yàn)成份，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差，個人的實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果會有較的重復(fù)性較差，個人的實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果會有較大的影響。大的影響。一、蛋白質(zhì)提取、純化的特點(diǎn)一、蛋白質(zhì)提取、純化的特點(diǎn)二、蛋白質(zhì)提取、純化前的準(zhǔn)備蛋白質(zhì)提取、純化前的準(zhǔn)備 在進(jìn)行生物大分子的制備前，通常需要對以下幾方面的在進(jìn)行生物大分子的制備前，通常需要對以下幾方面的內(nèi)容加以確定或預(yù)先了解。內(nèi)容加以確定或預(yù)先了解。 明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆？蒲小㈤_發(fā)，還是要發(fā)現(xiàn)新的明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆？蒲小㈤_發(fā)，還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。物質(zhì)。 通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握目的生物大分子的通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)

19、驗(yàn)，掌握目的生物大分子的理化性質(zhì)。如理化性質(zhì)。如分子大小；溶解度；電荷；吸附性質(zhì)；熱穩(wěn)定分子大小；溶解度；電荷；吸附性質(zhì)；熱穩(wěn)定性；對配體分子的生物學(xué)親和力等。性；對配體分子的生物學(xué)親和力等。 建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵。子的關(guān)鍵。 確定可能的技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)方案，這是最困難的過程。確定可能的技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)方案，這是最困難的過程。三、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟三、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟 1）選材：）選材： 制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)闹苽渖锎蠓肿樱紫纫x擇適當(dāng)?shù)纳锊牧稀Ｉ锊牧稀?原則：原則：原材料來源充足；

20、目標(biāo)蛋白含量豐富；易原材料來源充足；目標(biāo)蛋白含量豐富；易于處理和提取。于處理和提取。 2）生物材料的破碎和預(yù)處理：）生物材料的破碎和預(yù)處理：常用的方法有組織常用的方法有組織勻漿法、研磨、反復(fù)凍融、溶菌酶、高壓破碎。勻漿法、研磨、反復(fù)凍融、溶菌酶、高壓破碎。 目的：目的：將目標(biāo)蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與將目標(biāo)蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成分分離。其他成分分離。 3）粗分離：）粗分離：將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、等電點(diǎn)、超濾為離心、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、等電點(diǎn)、超濾等。等。 4）純化：）純化：將粗提物中的雜質(zhì)進(jìn)一步

21、去除的過程，將粗提物中的雜質(zhì)進(jìn)一步去除的過程，又稱為又稱為精制精制。方法為各種層析技術(shù)，特別是親和層析。方法為各種層析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。技術(shù)。 5）鑒定：）鑒定：包括包括3方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。貫穿于提取、純化的每一步。貫穿于提取、純化的每一步。 含量：含量：凱氏定氮法、凱氏定氮法、folin-酚試劑法（酚試劑法（lowry法）法）和紫外吸收法等。和紫外吸收法等。 純度：純度：生物大分子制備物的均一性（即純度）的生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個點(diǎn)，鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個點(diǎn)，或或hpl

22、c和毛細(xì)管電泳都是一個峰。末端和毛細(xì)管電泳都是一個峰。末端aa測定。測定。 活性：活性：比活或生物活性鑒定。比活或生物活性鑒定。 6）產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存）產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存。 第三節(jié)第三節(jié) 重組蛋白質(zhì)重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的提取、純化與鑒定的一般步驟及注意事項(xiàng)一般步驟及注意事項(xiàng)主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：一、一、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的特點(diǎn)；重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的特點(diǎn)；二、二、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的一般步驟；重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的一般步驟；三、三、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的注意事項(xiàng)。重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的注意事項(xiàng)。一、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的特點(diǎn)一、重組蛋

23、白質(zhì)提取、純化與鑒定的特點(diǎn) 與提取純化天然蛋白質(zhì)相比，重組蛋白質(zhì)的提取純化具與提取純化天然蛋白質(zhì)相比，重組蛋白質(zhì)的提取純化具有以下特點(diǎn)：有以下特點(diǎn)： 1. 1. 細(xì)菌、酵母、傳代細(xì)胞等表達(dá)體系組成背景清楚，細(xì)菌、酵母、傳代細(xì)胞等表達(dá)體系組成背景清楚，用它們表達(dá)的重組蛋白的提取純化簡單、容易；用它們表達(dá)的重組蛋白的提取純化簡單、容易； 2. 2. 分泌表達(dá)的蛋白更易提取純化，且不被細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌表達(dá)的蛋白更易提取純化，且不被細(xì)胞內(nèi)蛋白污染，特別是利用無血清培養(yǎng)時。污染，特別是利用無血清培養(yǎng)時。 3. 3. 同一種蛋白質(zhì)，應(yīng)用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，其提取同一種蛋白質(zhì)，應(yīng)用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，其提取純

24、化的策略可能完全不同。純化的策略可能完全不同。 4. 4. 可根據(jù)可根據(jù)不同的表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)易于提取純化目不同的表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)易于提取純化目的蛋白的表達(dá)策略。的蛋白的表達(dá)策略。二、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的一般步驟二、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的一般步驟 1. 1. 細(xì)胞（菌體）與培養(yǎng)基的分離。細(xì)胞（菌體）與培養(yǎng)基的分離。常用離心法（大量生常用離心法（大量生產(chǎn)可用連續(xù)離心機(jī)）。根據(jù)目的蛋白存在的部位，收集細(xì)胞或產(chǎn)可用連續(xù)離心機(jī)）。根據(jù)目的蛋白存在的部位，收集細(xì)胞或培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 2. 2. 細(xì)胞破碎。細(xì)胞破碎。常用的方法有超聲破碎、高壓破碎和反復(fù)常用的方法有超聲破碎、高壓破碎和反復(fù)

25、凍融等。凍融等。目的：目的：將目標(biāo)蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他將目標(biāo)蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成分分離。成分分離。若為分泌表達(dá)，本步驟可省略。若為分泌表達(dá)，本步驟可省略。 3. 3. 粗提。粗提。將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、等電點(diǎn)、超濾等。鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、等電點(diǎn)、超濾等。 4. 精制：精制：將粗提物中的雜質(zhì)進(jìn)一步去除。方法主將粗提物中的雜質(zhì)進(jìn)一步去除。方法主要為各種層析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。要為各種層析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。 基因工程包涵體在純化之前，需要可逆性的變性、基因工程包涵體在

26、純化之前，需要可逆性的變性、復(fù)性處理。復(fù)性處理。 5. 鑒定：鑒定：包括包括3方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。貫穿于提取、純化的每一步。貫穿于提取、純化的每一步。 含量：含量：凱氏定氮法、凱氏定氮法、folin-酚法（酚法（lowry法）和紫法）和紫外吸收法等。外吸收法等。 純度：純度：生物大分子制備物的均一性（即純度）的生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定。鑒定。要求：要求：一維電泳一條帶，二維電泳一個點(diǎn)，或一維電泳一條帶，二維電泳一個點(diǎn)，或hplc和毛細(xì)管電泳都是一個峰。末端氨基酸測定。和毛細(xì)管電泳都是一個峰。末端氨基酸測定。 活性：活性：比活或生物活性鑒定

27、。比活或生物活性鑒定。 6. 產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存。三、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的注意事項(xiàng)三、重組蛋白質(zhì)提取、純化與鑒定的注意事項(xiàng) 防止目的蛋白的降解是關(guān)鍵。措施如下：防止目的蛋白的降解是關(guān)鍵。措施如下： 1.1.對宿主細(xì)胞或目的蛋白進(jìn)行基因操作，防止蛋對宿主細(xì)胞或目的蛋白進(jìn)行基因操作，防止蛋白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或細(xì)胞；融合白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或細(xì)胞；融合表達(dá)等。表達(dá)等。 2.2.從重組蛋白溶液中除去蛋白酶。從重組蛋白溶液中除去蛋白酶。 3.3.抑制蛋白酶活性。如抑制劑（抑制蛋白酶活性。如抑制劑（edtaedta、pmsfpmsf），），降低操

28、作溫度等。降低操作溫度等。 4.4.迅速將表達(dá)的目的蛋白脫離表達(dá)體系。迅速將表達(dá)的目的蛋白脫離表達(dá)體系。 注意：應(yīng)同時聯(lián)合應(yīng)用幾種方法。注意：應(yīng)同時聯(lián)合應(yīng)用幾種方法。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)技術(shù)蛋白質(zhì)技術(shù)1. 蛋白質(zhì)提取純化技術(shù)；蛋白質(zhì)提取純化技術(shù)；2. 蛋白質(zhì)含量（純度）、蛋白質(zhì)含量（純度）、活性及活性及結(jié)構(gòu)測定技術(shù)結(jié)構(gòu)測定技術(shù)；3. 免疫化學(xué)技術(shù)；免疫化學(xué)技術(shù)；4. 蛋白質(zhì)的化學(xué)合成與修飾技術(shù)；蛋白質(zhì)的化學(xué)合成與修飾技術(shù)；5. 蛋白質(zhì)組研究技術(shù)（蛋白質(zhì)組研究技術(shù)（2-de）。蛋白質(zhì)含量（純度）測定技術(shù)蛋白質(zhì)含量（純度）測定技術(shù) 蛋白質(zhì)定量測定技術(shù)是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的蛋白質(zhì)定量測定技

29、術(shù)是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析技術(shù)之一。蛋白質(zhì)定量測定的方法很多，基本上都是根據(jù)分析技術(shù)之一。蛋白質(zhì)定量測定的方法很多，基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)或生物學(xué)特性建立的。蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)或生物學(xué)特性建立的。 目前，常用的方法有：定氮法，比色法（目前，常用的方法有：定氮法，比色法（folin酚試劑法酚試劑法(lowry法）、考馬斯亮藍(lán)法（法）、考馬斯亮藍(lán)法（bradford法）、紫外吸收法和雙法）、紫外吸收法和雙縮脲法縮脲法(biuret法法)。其中。其中l(wèi)owry法和法和bradford法靈敏度最高，比法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏紫外吸收法靈敏1020倍，比倍，比biuret法靈

30、敏法靈敏100倍以上。定氮法倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。微量凱氏（微量凱氏（kjeldahlkjeldahl）定氮法）定氮法 蛋白質(zhì)的元素組成中，氮的含量較為恒定，平蛋白質(zhì)的元素組成中，氮的含量較為恒定，平均為均為1616，即，即1g1g氮相當(dāng)于氮相當(dāng)于6.25g6.25g蛋白質(zhì)。而生物樣蛋白質(zhì)。而生物樣品中非蛋白含氮化合物的量通常較小，故只要從生品中非蛋白含氮化合物的量通常較小，故只要從生物樣品中測定出總含氮量減去非蛋白含氮量，即可物樣品中測定出總含氮量減去非

31、蛋白含氮量，即可推算出樣品中蛋白質(zhì)含量。定氮法比較復(fù)雜，但較推算出樣品中蛋白質(zhì)含量。定氮法比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理: 樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨；樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨；氨與硫酸作用，變成硫酸氨；經(jīng)強(qiáng)堿堿化又分解釋氨與硫酸作用，變成硫酸氨；經(jīng)強(qiáng)堿堿化又分解釋放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。 計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中計(jì)算所

32、得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白氮含量，須將總氮量減去非蛋白氮。蛋白氮含量，須將總氮量減去非蛋白氮。 樣品中蛋白質(zhì)的含量，用樣品中蛋白氮含量樣品中蛋白質(zhì)的含量，用樣品中蛋白氮含量 6.25即得。即得。雙縮脲法（雙縮脲法（biuretbiuret法）法） 實(shí)驗(yàn)借助于蛋白質(zhì)分子中肽鍵與雙縮脲試劑特殊實(shí)驗(yàn)借助于蛋白質(zhì)分子中肽鍵與雙縮脲試劑特殊的顏色反應(yīng)，通過分光光度計(jì)測定待測蛋白質(zhì)在的顏色反應(yīng)，通過分光光度計(jì)測定待測蛋白質(zhì)在540nm處的光密度值。處的光密度值。 以已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白的光密度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白以已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白的光密度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)制作濃度濃度為橫坐標(biāo)制作濃度-光密度

33、標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 雙縮脲（雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個分子脲經(jīng)）是兩個分子脲經(jīng)180左右左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與與cuso4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應(yīng)。基或兩個以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應(yīng)。 紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋

34、白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為為110mg/ml蛋白質(zhì)溶液。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸蛋白質(zhì)溶液。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。緩沖液和某些氨基酸等。紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物folinfolin酚法（酚法（lowrylowry法）法） 此法是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，此法是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，folin酚試劑法最早由酚試劑法最早由lowry建立，是最靈敏的測定建立，是最靈敏的測定方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，方法之一。此法的顯色原理與雙縮

35、脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即只是加入了第二種試劑，即folin酚試劑，以增加酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。方法的靈顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。方法的靈敏度好于雙縮脲法，是目前教學(xué)、科研常用的蛋白質(zhì)敏度好于雙縮脲法，是目前教學(xué)、科研常用的蛋白質(zhì)含量測定方法。含量測定方法。 本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用folin酚試劑和未知蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生酚試劑和未知蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，通過分光光度計(jì)測定其在藍(lán)色反應(yīng)，通過分光光度計(jì)測定其在700nm處的光密處的光密度值，以已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白的光密度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋度值，以已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白的光密度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)制作濃度白濃度為橫坐標(biāo)制作濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物，并使肽鏈展蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物，并使肽鏈展開，其中的酪氨酸和色氨酸殘基充分暴露出來；開，其中的酪氨酸和色氨酸殘基充分暴露出來；folin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（