1、 40-免疫分型教程(1)正常骨髓免疫分型 上圖是正常骨髓經CD45、CD71、CD33染色后組成的CD45/SSC、CD71/CD33雙參數散點圖；通過這兩個組合，能夠分辨骨髓的正常細胞、檢查是否有異常細胞存在、評估細胞的成熟情況。CD45/SSC圖中可見：1，CD45強陽性SSC低信號的細胞群為淋巴細胞（褐色細胞群體）；2，中等強度的CD45表達，SSC信號最強的細胞群體為粒細胞（藍色及紅色細胞群體）；3，CD45表達與SSC信號介于淋巴細胞與粒細胞之間的是單核細胞群體（綠色細胞群體）；4，CD45陰性，SSC信號最低的有核紅細胞和細胞碎片；CD33/CD71圖中可見：1，CD33表達最強

2、的單核細胞群體（綠色）；2，粒細胞CD33表達較單核弱，不成熟粒表達CD71，成熟后不表達。3，淋巴細胞、有核細胞和細胞碎片不表達CD33、CD71。CD11B/CD15圖可用來評估髓系細胞向單核、粒分化的程度（隨著髓細胞成熟，細胞逐步獲得CD11B，粒細胞高表達CD15）：1，單核細胞（綠色）高表達CD11B，CD15中等到表達；2，粒細胞（藍色及橘紅色）高表達CD15，藍色成熟粒CD11B表達較橘紅色不成熟粒細胞強，幼稚髓細胞僅表達CD15而無CD11B。3，T、B淋巴細胞不表達CD15、CD11B，NK細胞表達CD11B而無CD15（紅色細胞）。4，有核紅細胞及碎片不表達CD15和CD1

3、1B。 根據骨髓細胞CD45/SSC圖中分布情況設門圈定各類細胞：R1門為成熟淋巴細胞；R2門為正常單核細胞位置；R3門正常粒細胞位置；R4門為幼稚淋巴細胞出現位置；R5門為有核紅細胞或細胞碎片位置；R6門為幼稚髓細胞出現位置；白血病細胞通常會在R4、R6兩門位置處出現。M0免疫分型M0:急性髓細胞白血病微分化型 原始細胞在光鏡下類似L2型細胞,核仁明顯,胞漿透明,嗜堿性,無嗜天青顆粒及Auer小體,髓過氧化酶(MPO)及蘇丹黑B陽性細胞<3%;電鏡下,MPO(+);CD33或CD13等髓系標志可呈(+),淋巴系抗原通常為(-),但有時CD7+,TdT+;部分急非淋白血病可表現CD7+,

4、TdT。形態學：幼稚細胞占骨髓有核細胞90%以上；腫瘤細胞不出現AUER小體；粒細胞缺少，MPO或蘇單黑染色陰性。遺傳學：染色體常有復雜的異常，特別是5和7號染色體。當病例伴T（9；22）時會出現淋系抗原。幼稚細胞群體的FS和SS信號低，在CD45/SS點圖中特征性地與幼稚淋巴細胞區域相連。幼稚細胞至少表達一種骨髓抗原：CD13，CD33，但完全缺乏髓系成熟分化抗原：CD11B，CD15和CD16。相當一部分病例TDT陽性，但在腫瘤細胞上分布不均。腫瘤細胞通常淋系抗原陰性，但有時也會表達CD7或CD4；HLA-DR通常陽性，CD34則為陰性。有學者指出伴CD7和CD34同時表達的病人預后不佳。

5、檢測胞漿內MPO比CD33/CD13聯合檢測更為敏感。M0中MPO陽性率一般小于3%，如大于3%則要判定為M1。M0:HLA-DR+,CD34+,CD13+/-,MPO+,CD14-,CD11b-,TdT-/+to+/- 骨髓樣本類似純化的培養細胞，在CD45/SSC圖中可見到數量占絕大多數的一群幼稚細胞群體。這群異常細胞在的SSC信號較低，大小中等。幼稚細胞CD19、CD34陰性，但同時表達CD13和CD33。CD13表達稍弱，且抗原表達較CD33不均一。白血病細胞占了所有細胞群體的96%。HLA-DR在這些髓系細胞上不表達。這些幼稚細胞表型的情況是：CD13陽性，CD33陽性，C

6、D34陰性，HLA-DR陰性。這個表型與AML-M3相以。腫瘤細胞不表達CD71、CD117、CD18、CD11b和CD15。CD64是陰性，但CD14表達。CD14表達強度比較弱與CD13相似。T細胞標志物CD2、CD5、CD3和CD7都不表達。在圖中可觀察到殘存的一些T細胞。與陰性對照相比，CD4弱陽性表達。診斷：AML微分化型，CD34和HLA-DR陰性。實驗室進一步診斷：MPO（免疫組化）陽性，NSE陰性，46XY，t(3;5)(q25;q34)重要說明：本例中白血病細胞免型表型為：CD34-、HLA-DR-，CD13+，CD33+，表面看與AML-M3相似。在許多幼稚細胞胞漿內存在的

7、顆粒會導致AML-M3的誤診。但FCM的數據提供了一些有價值的信息避免這個錯誤。具體總結如下：（1）表達CD14（克隆號leu-M3），盡管表達有所降低；（2）SSC信號降低并且相對分散。這一點十分重要，因為AML-M3v的SSC信號比較集中，甚至M3v細胞中帶有顆粒。另一重要信息是CD13表達下降甚至缺失而CD33強陽性（一種異常的CD13/CD33表達模式）。有時AML-M3可能會缺失表達CD13。對于這些疑難病例需要借助分子遺傳學和細胞遺傳學診斷工具來建立正確的診斷。其他標記物如：B cells (CD19, CD20, Kappa, Lambda), CD10(Calla), CD5

8、(T cells), CD41 (platelet)都是陰性。光散射圖中顯示在前向散射光和表示顆粒度的側向散射光有一群處于中間位置的細胞。這與組織學檢測結果相一致。（暫無圖）將光散射圖中的異常細胞放置于CD45/CD14上顯示發現CD45陽性并CD14陰性（99%）。CD45表達強度低于成熟淋巴細胞，可能是由髓系細胞和未成熟幼稚細胞組成。 （暫無圖）在HLADR/CD3等高圖中發現其中大部分DR陽性（81%）并且CD3陰性（T細胞受體）。這個表型可見于活化的T細胞和成熟B細胞（CD45強陽性）。DR表達于絕大多數髓系細胞、B細胞和活化的T細胞。 CD34/CD38圖中顯示細胞CD34

9、陰性并且CD38陽性。CD38可見到漿細胞、前B細胞、單核細胞、ALL細胞和絕大多數AML細胞。此處可排隊漿細胞的可能性（CD45陰性），前B細胞還無法排除，單核細胞可排除（CD14陰性）。CD13/CD15等高圖中顯示大部分細胞（63%）髓系抗原CD13/CD15陰性。但此處提供了一絲線索，因為有些細胞（30%）表達低水平CD15。絕大部分AML M1-M6細胞同時表達CD13和CD15。從CD33/TdT圖中可以肯定這些細胞源自髓系（CD33陽性）。無細胞表達TdT。這表明這些細胞是處于極早期的髓系細胞，可能AML-M0/M1。CD11b/GPA雙參數圖中也證實了這些細胞早期髓系的屬性。G

10、PA在這些細胞上弱表達。這種情況可見于早期髓系干細胞。CD11b可見于單核細胞、粒細胞，NK細胞不表達此抗原。 這些細胞還同時表達CD7。這使人感覺有誤，但現已知早期髓系白血病細胞可偶然同時表達CD7。將這些結果綜合來看支持M0或M1的診斷。要用流式細胞儀來區分M0和M1現還有困難。所以還要結合組織學檢測的結論，如發現有MPO陽性則支持M1，如陰性則為M0。M1免疫分型幼稚細胞成群，RALS信號弱。M1與M0很難區分，但M1 細胞大小及顆粒度較M0稍大，與原粒細胞接近。至少伴隨一種髓系抗原：CD13或CD33。高表達HLA-DR，CD34陽性但較M0弱,>3%的幼稚細胞表達MP

11、O，較M0多。不表達CD11B，CD15，CD16等。 M1:CD11B-/+,HLA-DR+,CD13+,CD33+,CD34+,CD14+,MPO+,TdT-/+to+/-M2免疫分型CD45/RALS圖中細胞分布廣泛與M1不同，這是因為M2細胞已進一 步分化幼稚細胞減少，粒細胞增多并與BLAST WINDOWS區域內細 胞相連。因細胞沒有明顯分群，很難將異常細胞與正常相區分， 故設立多個門進行分析檢測其成熟度抗原的表達情況。M2免疫表型與M1類似，HLA-DR，CD33，CD13陽性。上圖中可見 幼稚細胞CD33與CD71表達均比成熟粒細胞強。CD13表達強于CD33。M2腫瘤

12、細胞弱表達CD15與CD11B,說明細胞已分化。 CD34表達顯著降低。M2腫瘤細胞不表達CD5,CD7和TdT等抗原，如病例伴t(8;21),則 經常表達CD19偶表達CD56。一般腫瘤細胞MPO強陽性。偶見形 態為M2并伴t(8;21)，但CD13-，CD33-，CD14-，而MPO+。細胞分布廣泛，幼稚細胞較M1少。CD13和CD33陽性，且CD13表達高于CD33。HLA-DR陽性，CD15弱陽性。M2腫瘤細胞伴t（8，21）CD19陽性。M3免疫分型上圖為M3V，少顆粒型早幼粒白血病細胞，細胞中顆粒少RALS信號 低而集中，SS座標上出現大量腫瘤細胞。腫瘤細胞大，FS信號強。 通過C

13、D45/RALS雙參圖可辨別出M3與M3V。下為經典M3多顆粒細胞的 CD45/RALS和SS/FS圖。M3與M3V在免疫表型上無區別。M3腫瘤細胞特征性地不表達髓系早期標志物CD34和HLA-DR；部分病例中CD9特征性地陽性，但不是完全特異。CD2在M3與M3V中會出陽性表達，在HLA-DR陰性的病例中，與染色體t(15,17)異常相關。腫瘤細胞CD33表達比正常粒細 胞強與正常單核細胞相似， CD13表達多樣。腫瘤細胞不表 達晚期髓細胞分化抗原CD15， CD16和CD11B。腫瘤細胞完全不表達CD15，與正常早幼粒細胞表達CD15相區別；正常早幼粒細胞細胞周期中含高比例S期細胞，而腫瘤

14、細胞中幾乎不見細胞周期。腫瘤細胞MPO陽性，上圖中MPO與LACTOFERIN雙染來區分成熟粒 細胞。腫瘤細胞除表達CD2外，很少表達T或B系抗原。M3腫瘤細胞因其胞漿內多顆粒，細胞具有很強的自發熒光。M3:CD33+,CD13+,MPO+,CD34-,HLA-DR-,CD11b-,CD14-,CD15-,TdT-M4免疫分型典型的M4病例CD45/RALS圖中會出現一群異常的單核細胞和一群骨髓幼稚細胞，腫瘤細胞較M0，M1細胞的FS和SS信號增強。有時這兩群細胞會相互疊加占據BLAST WINDOWS和成熟單核細胞位置，故難圈出獨立成群的腫瘤細胞。對于M4病例一般都設多個門對異常細胞進行分析

15、，且每個異常細胞群根據其成熟度的不同，表型也可能互不相同。本例為M4EO，增多的嗜酸細胞RALS信號與早幼粒相似CD45信號與單核細胞相似，本例中為R4門中紫色細胞。幼稚細胞群表達CD34，HLA-DR，而異常單核細胞則CD34陰性，HLA-DR陽性。幼稚細胞CD33陽性，CD14陰性，而異常單核細胞則為CD33陽性，CD14，CD64陽性。CD64表達如象本圖中強陽性表達則為單核細胞特異性標志。M4腫瘤細胞在CD11B/CD15圖中會特征性分布如上，存在幼稚細胞及各期的粒細胞及單核細胞。CD2表達與M4EO有很大相關性，可能與16號染色體異常有關。M4/blast population: C

16、D13+,CD33+,CD34+,HLADR+,CD11b-,CD14-M4/abnomal monocytic cell:CD13+,CD33+,CD34-,HLA-DR+,CD11b+,CD14+/-,CD4+/-M5免疫分型M5腫瘤細胞從細胞大小、顆粒度和CD45表達都向成熟單核細胞過渡，形成一大細胞群體。M5分為二個亞型M5a和M5b，前者細胞稍大，與成熟單相比CD45表達弱但不獨立成群。髓系細胞的分化情況可從CD15/CD11B雙參數圖中觀察,本例中腫瘤細胞CD15較平常高,但低于右上角黑色的粒細胞.不成熟的單核細胞CD11B表達弱.如出現CD33陽性，CD13，CD34陰性。M5腫

17、瘤細胞通常高表達CD33，CD13表達多樣。CD4是髓系幼稚細胞向單核系分化的敏感指標。CD14一般表達在成熟單核細胞上，本例中腫瘤細胞CD14陰性，CD64陽性。AMML病例中，CD64在單核細胞上表達特別強。本例中CD61弱陽性,這種情況是由于幼稚細胞與血小板粘附造成的。M5a: HLA-DR+,CD11b+/-,CD34+,CD33+,CD13+,CD14-/+,CD4+/-M5b: HLA-DR+,CD11b+,CD34-,CD13+,CD16+/-,CD14+,CD4+/-M6免疫分型本例中可見兩群幼稚細胞，M6的定義是紅系祖細胞占骨髓幼稚細胞群體的50%強，而其他系別的幼稚細胞可占

18、30%以上。固診斷M6時要依據形態學紅系細胞的數量來確定，如僅根據免疫分型很難得出正確診斷，必須結合形態計數幼稚細胞數量來確定。以上是典型的M6免疫分型圖，出現兩群幼稚細胞。腫瘤細胞可通過CD71強陽性表達加以確認，在一些紅細胞稍成熟病例中血型糖白A陽性。HLA-DR，CD34和CD33或CD13通常陽性。很多M6病例中會出現一群髓系幼稚細胞，如本例中的紅色細胞群體。M6;CD71+,GP-A+,CD34+/-,HLA-DR+/-,CD13+/-,CD33+/-,CD34+/-,CD14-,CD11b-M7免疫分型本例中幼稚細胞CD45/RALS信號都不強。與B-ALL，M6的腫瘤細胞相似。M

19、7腫瘤細胞表達CD61和CD41，髓系抗原表達多樣。成熟血小板粘附地白細胞也會表達CD41和CD61，這時會對診斷產生影響，此時要加做CD62來確認是否為成熟血小板粘附造成CD41或CD61陽性。本例CD34陽性，CD71弱陽，其他系別抗原不表達。其他系別抗原均為陰性，與M0、M1相似。M7:HLA-DR+,CD34+,CD33+/-,CD14-,MPO-,TdT-TALL 免疫分型T-ALL的腫瘤細胞CD45表達較B-ALL細胞強，腫瘤細胞在CD45/SSC圖中可能會出現在BLAST WINDOWS或單核細胞區或 與正常淋巴細場胞相混。本例中腫瘤細胞CD10陽性，約三分之一的T-ALL會出現

20、該 現象，但CD19絕對陰性。本例CD34陽性，約40%的T-ALL的腫瘤細胞CD34陽性，與細胞是否表達原始或成熟表型無關。T-ALL腫瘤細胞表面CD3經常陰性,但如用PE標記的CD3抗體則經常能檢測到弱陽性。CD3/CD5雙參數圖中，腫瘤細胞總出現在正常T細胞以外的位置上,上圖中黑色陽性顆粒為正常T細胞.腫瘤細胞CD4/CD8表達多樣化,但是總與正常T細胞的表達不兩只,如發現CD4/CD8雙陽性則提示為T-ALL。T-ALL最敏感的指標是CD7,但其特異不強有近30%的AML同樣陽性。當CD7與HLA-DR聯用時其特異性增強，許多T-ALL，特別是在兒童，CD7強陽性而不表達HLA-DR，

21、而在AML中CD7弱表達并伴HLA-DR陽性。T-ALL因與T細胞的成熟度相關，可被分為三期：pre-thymic：CD7+，CD1a-，CD4/8-，CD3-；thymic:CD7+，CD4/8+，CD3-；matrue:CD3+,CD1a-;原始T細胞ALL與AML很難區分，要加測胞漿內CD3。T-ALL最常見的表型是：CD2，CD5，CD7，CD1，CD4/8雙陽性，CD3弱陽性，TdT強陽性。次其次為：CD2，CD5，CD7 和TdT強陽性。再次為：CD2，CD5，CD7伴CD4或CD8部分表達，CD3表達少并少量表達TdT。T-ALL的共同特征是：下調表達T系抗原或出現異常抗原的聯合

22、表達。B ALL免疫分型急性B淋巴細胞性白血病可大致分為早前B-ALL，前B-ALL和成熟B-ALL，區分他們的依據是免疫球蛋白的表達及其表達位置。 具體情況如下：1,成熟B細胞ALL表達表面免疫球蛋白（sIg）2,前B細胞ALL細胞胞漿內表達免疫球蛋白重鍵(cu)而不表達輕鏈3,早前B-ALL則兩者都陰性然而上述情況在用于診斷B淋巴細胞性白血病時常出現混淆。因為胞漿內免疫球蛋白重鏈cu在診斷過程中很少被檢測，從而那些表面Ig陰性的病例全都被歸于前B-ALL。早前B細胞型（B-precursor or early pre-B）占兒童急淋的65%左右，占成人的50%左右。 白血病細胞，根據形態對

23、應FAB的L1或L2型，處于B細胞成長的最原始階斷。 細胞小而無顆粒，流式細胞分析期細胞的前向和側向光信號很弱；特異性地，其細胞表面或胞漿內不表達免疫球蛋白。 白血病細胞通常至少部分地表達干祖細胞抗原CD34和不成熟淋巴細胞抗原HLA-DR或TdT。 另外，少數罕見病例會同時表達CD10和B細胞相關抗原CD19。其他在早前B細胞型白血病細胞上表達的 B細胞抗原有CD9，CD22和CD24；這些抗原通常在B細胞成熟的中晚期才表達。 CD20也是一具有廣泛意義的抗原，但它的表達變異很大，會經常出現CD20陰性的細胞；這種混合型表達CD20與以CD20集中地、高表達的成熟B細胞有很大的區別。早前B白

24、血病細胞的免疫表型與正常原B細胞很相似，但白血病細胞抗原的異常表達常會出現：同時異常地表達早期和成熟抗原，異常地抗原交叉表達（特別為髓系抗原），或最常見的為抗原表達的強度變化。在兒童ALL中，早前B細胞白血病的免疫分型與疾病預后有很大的相關性，除CD10陰性的腫瘤特別是嬰兒，其預后一般較好。 嬰兒CD10陰性的白血病事實上經常會出現染色體11q23異常,從而導致MLL基因重排，預后差。其他"11q23異常的白血病"可出現的免疫表型包括表達髓系抗原CD15并失去抗原CD24。 白血病細胞通常會表達CD34和其他一些髓系抗原，但表達情況多變。 除表達髓系抗原外，細胞還會強表達B

25、系抗原CD19。 其他一些預后比較差的如t(9;22)并由此而形成BCR-ABL融合基因病例，這種情況多見于成人ALL，而兒童相對少見，由引可解釋為什么成人ALL的預后較兒童的差。 Ph1染色體陽性的病例經常會表達髓系抗原，這與CD34、CD10、CD19和CD25表達有重要關系，但目前尚無相關性的統計數據來定義此亞型。 一些兒童早前B細胞白血病預后特別好，除上述病例中超二倍體腫瘤以外，那些伴t(12;21)(p21;q22)的病例預后也較好。這些易位產生了融合基因TEL/AML1，并主要見于種早前B細胞白血病，并且好發于1-10歲的兒童。流式免疫分型發現，這些病例特異地強表達CD19，CD10和HLA-DR，并會出現雙峰表達CD34，部分細胞表達或失去CD9，部分細胞弱表達CD20。CD66c（KORSA-3544）一致地不表達。CD10高表達伴CD9和CD20弱表達與TEL/AML1融合基因的產生有緊密關系。B-precursor-ALL的腫瘤細胞FS/SS信號弱，CD45表達也不強，有些病例的腫瘤細胞在CD45/SSC圖中與有核紅細胞位置相當。B-precursor-ALL對應于FAB分型的L1和L2型。B-precursor-ALL的腫瘤細胞CD10/CD19強陽性，CD33弱陽性如使用PE標記的CD33抗體檢測陽性增強但不可據此判定為混合型白血病。通常根據CD10表