1、實驗十一：細胞內化學成分的顯示方法酸性磷酸酶的顯示 【課前預習】 1溶酶體分為幾類，各有何特點？ 2溶酶體是如何形成的？其標志酶是什么？如何在顯微鏡下顯示？ 3溶酶體具有哪些功能？ 【目的要求】 1熟悉酸性磷酸酶顯示方法的原理及操作步驟 2觀察酸性磷酸酶在細胞中的分布 【基本原理】 1細胞化學：細胞化學是在保持細胞原有形態結構的基礎上，利用已知的化學反應原位顯示細胞內的某種化學成分，然后通過顯微鏡進行定性、定位、定量研究的科學。 2細胞化學技術要求：保持樣品的形態結構不發生改變；保存細胞內生前化學成分及酶的活性；顯示成分的化學反應必須對將被顯示的化學物質有高度特異性和高度靈敏性；反應所生成的產

2、物要在原位沉淀、顯色明顯、不溶、不擴散，并在重復實驗中結果一致。 3染色的作用：由于正常的生物組織是無色透明的，因此無法在光鏡下進行觀察。因此必須要對樣品進行染色；染色劑可以滲透到組織的間隙中，細胞中的蛋白質等成份可以吸附不同的色素粒子；染色劑中的陽離子和陰離子可分別與細胞中的酸性、堿性物質相結合。染色就是根據這些原理，利用染色劑與細胞內含物的物理作用與化學作用，將細胞和組織染成各種不同的顏色；由于染色劑的化學性質不同，以及固定材料時所用的固定劑不同，染色劑對被染色的組織有一定的選擇性，從而使某些部位染色很清楚，而另一些部位可能完全不著色。例如，有些染色劑可染細胞核，有些染色劑可染細胞質。 4

3、染色的方法：（1）利用化學原理進行的染色方法：金屬沉淀法：利用酶催化反應形成的分解產物與金屬化合物反應，最終生成有色沉淀，借此辨認所要檢查的酶的活性。偶氮偶聯法：用人工合成的酶底物在酶的作用下產生分解產物，后者與重氮鹽結合形成不溶性的偶氮色素。schiff反應法：游離的醛基可使schiff試劑中的無色品紅變為紫紅色產物，這種反應通常用于顯示多糖類（pas反應）和脫氧核糖核酸（feulgen反應）。聯苯胺法：過氧化物酶分解h2o2產生氧，后者再將無色聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。四唑鹽顯示脫氫酶；（2）利用物理學原理進行的染色：脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。熒光分析：借

4、某些物質可被紫外線激發產生可見熒光而被顯示。也可用熒光染色法將特定的熒光染料對細胞中的化學成分染色，在熒光顯微鏡下對這些成分進行直接觀察。放射自顯影技術：用放射性核素標記化合物，使其在細胞中參與代謝，將帶有標記的代謝產物通過放射自顯影技術顯示出來，借以探測物質代謝途徑和細胞增殖周期；（3）利用免疫學原理的染色方法：大分子物質具有免疫原性可制備特異抗體。用各種標記物如熒光素、辣根過氧化物酶和膠體金等標記該抗體，利用免疫學抗原抗體反應原理，用標記抗體顯示相應抗原。 5酸性磷酸酶的顯示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，acp）主要存在于巨噬細胞，定位于溶酶體內。在溶酶體膜穩定完整時

5、，底物不易滲入，acp活力微弱或無活性，經固定，在合適ph條件下，膜本身變為不穩定，逐漸改變其滲透性，底物可以滲入，酶活力被顯示。acp在酸性條件下（ph4.7）可使作用液中的底物-甘油磷酸鈉的磷酸根解離出來，進而與溶液中硝酸鉛結合形成磷酸鉛沉淀，因其是難溶解的無色沉淀物，需要與黃色的硫化銨作用，生成棕黑色pbs沉淀而被顯示出來。 -甘油磷酸鈉 甘油+po3- po4 +pb（no3)2 pb2（po4)2 pb2（po4)4 +（nh4)2s pbs 【實驗用品】 1器材：注射器、解剖用具、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片 2試劑：3%淀粉溶液；acp作用液；2%硫化銨 gomori硝酸鉛作用液

6、0.05moll醋酸緩沖液（ph5) looml 0.6醋酸加蒸餾水200ml、取其 42ml 醋酸鈉1.36g加蒸餾水200ml，取其158ml共200ml b-甘油磷酸鈉 2g 醋酸鉛 2g 5氯化鎂 5ml 以上作用液在臨用時配制，最終在ph55.2，過濾使用。 3材料：小鼠腹腔液涂片 【方法步驟】 1免疫動物：實驗前46天用無菌注射器取已滅菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔內，每天一次。 2頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔。 3吸取少量腹腔液，在玻片上涂層一薄層，室溫晾干。 4將涂片滴置于溫盒中，滴加適量acp作用液，37作用30分鐘。取出后，蒸餾水漂洗。用10%甲醛鈣溶液后固定5min。 5玻片入2%硫化胺溶液作用23min，進行顯色。取出后蒸餾水漂洗，鏡檢。 6對照組的作用液中不加-甘油磷酸鈉，而以蒸餾水代替；或入作用液前先用高溫（50）處理30min，使酶失去活性，作好標記，然后同時進行上述實驗。 【實驗結果】 酸性磷酸酶活性結構呈棕黃色至棕黑色