1、流式細胞儀熒光補償在流式細胞儀分析中用到的“熒光補償”這個術語是指修正熒光滲漏的過程,如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。熒光補償過程從原理上來說相對簡單，但實際上涉及許多精細、敏感的方面從而使在實踐操作相當復雜。關鍵詞：熒光補償細胞 在流式細胞儀分析中用到的“熒光補償”這個術語是指修正熒光滲漏的過程,如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。熒光補償過程從原理上來說相對簡單，但實際上涉及許多精細、敏感的方面從而使在實踐操作相當復雜。非常不幸，熒光補償操作可能是在流式操作中的數據采集和分析等步驟中最少被了解和掌握的內容，可能是因為在介紹它時 經常要用到線性代數來計算，并且還

2、要求了解它的產生原理。然而，正確的熒光補償對于許多流式分析來說絕對是至關重要的，特別是對現常見的多抗原熒光表達強 度分析。因為熒光補償常被誤解、誤用并被許多不正確的觀念所包圍，許多實驗室的熒光補償設置都不正確。本章的一個部分將剖析有關補償的一些疑惑問題。圖1顯示在設置熒光補償中常犯錯誤。本章將致力于從以下方面闡述流式細胞儀熒 光補償問題：為什么它是必須的，它是如何通過硬件或軟件來完成的，熒光補償是如何時影響數據視覺效果的，最后是如何設計一個最佳的實驗來獲得一個正確的熒 光補償。通過完整地閱讀本章節，讀者將學會為實驗正確地設置熒光補償并在出版物中識別出補償設置不當的數據，并能夠明白這些錯誤是如何

3、影響分析結果的。盡 管全面的闡述熒光補償不可避免地要涉及到一些線性代數的問題，但正確掌握熒光補償并不一定要求要掌握它；在這兩部分內容中的問題可根據你的意愿撇去或跳 過。大部分的流式用戶不能正確回答圖1中的三個問題。對于問題1的正確答案是“樣本2”。對于問題2，答案中十字門虛線的位置就不正確。最后，第三個問題的正確答案是：“不可能決定哪個圖形中的熒光補償是正確的”，因此其中沒有哪個可以說中正確的。如果一個正確的熒光補償對于流式數據分析這么重要，并且又這么少的人知道如何正確地去設置它，而為什么到目前為止流式細胞儀的分析結果還都不錯。對于此問題的簡單答案是絕大多數類型的數據分析并不絕對需要正確的熒光

4、補償。此問題的另一個答案是不正確的熒光補償在雙色或三色分析中顯得并不十分重要。然而隨著五色分在大多數實驗室中開展，如果這些個問題持續下去將會導致實驗失敗。 舉例來說，思考在圖1中的圖譜，可以發現即使熒光補償并不正確但仍可以正確計算細胞亞群的比例。然而計算這些細胞亞群的比例必須以單染的樣本為對照，而不是以各個熒光的同型對照染色為對照！正確的設門應該是以CD3FITC和PEisotype染色樣本為基礎。 圖1中還顯示了熒光補償在正確檢測抗原熒光表達強度中重要影響。在此，任何不正確的熒光滲漏都會誤導分析結果。此 外，正確的熒光補償在將弱陽性群體與陰性群體正確區分中有極其重要的作用

5、；熒光補償不足會導致弱陽性群體是假陽性顆粒增多，而過度補償則會丟失弱陽性群體 而導致假陰性。注意在補償調節不當的數據中正確計算的亞群數量的現象在三色或更多熒光分析實驗中可能不成立。在本章的結尾將給出一 個計算失敗的這種案例。此外還討論了如何為分析數據設計一個正確的染色對照（甚至當熒光補償設置并不正確時）。這些稱為“缺一型熒光染色”或FMO對照是 進行正確多色熒光分析的前提保證。  熒光補償基礎熒光補償是指修正熒光光學信號在探測器之間相互滲漏并被數字化檢測的過程。圖1 你能看出以上哪個樣本的補償是正確的嗎？在這個假設實驗中模擬了外周血用FITC標記的CD3和PE標記的陰性對照

6、作為質控物。在（A）和（B）中，居左 上方的圖形顯示了未調節補償的數據。每張以數字編號的圖形顯示補償設置逐漸增加的過程（FITC與PE兩探測器之間）。在B組圖中，顯示了同一樣本的檢測 數據，但在信號收集時PE探測器的電壓很低。請回答問題：（1）在A組圖中（1、2、3、4）哪個補償調節是正確的？（2）你是依據什么來判斷的？（3） 在B組圖中哪個補償調節是正確的？請在本文的介紹部分參閱以上問題的答案。自單激光雙色分析出現后此過程變得十分重要。每種熒光素分子都具有自身的光譜發射范圍。這些發射光譜之間存在相互疊 加，在某些情況下此現象十分明顯。舉例來說，如圖2為FTIC與PE熒光發射光譜的疊加情況。在

7、一個雙探測器系統中，可設計將FITC熒光從PE熒光中分 離出來。檢測熒光發射光時根據其波長和分布將選擇其中一小部分進入探測器，這部分熒光可由不同的濾光片從全部發射光中選擇特定波長范圍的熒光來獲得。這 樣，FTIC熒由530nm的濾光片選擇后送入探測器中；PE熒光則是由575nm濾光片來選擇。但是有部分FITC熒光會出現在PE探測器中，這是因為 它的發射光涵蓋兩個探測器濾片的過濾范圍。這部分信號我們稱之為熒光滲漏，因為它是由FITC熒光滲漏到PE探測器中的。注意想要設計一組熒光濾片來只收 集FITC或PE信號是不可能的；因為當同事使用這兩種熒光染料時 熒光疊加總是存在的。這樣只要FITC熒光存在

8、，就會在530nm區得到一個信號，同時也會在575nm區得另一些信號。如這時有PE熒光存在，它也將在 575nm區收集。那我們如何才能計數多少信號是來自PE而又有多少信號是由FITC引起的呢？這個計算過程我們稱為“熒光補償”，如去除FITC在PE 發射光譜帶上的熒光來修正PE探測器中的信號。 一步法熒光補償如果一種熒光染料的 發射光可以被兩個含有不同波段的濾光片的探測器檢測到（如，在發射光譜的不同區域檢測），那么就能根據其中一個探測器的信號計算出另一個探測中有多少信 號。這是因為這兩個信號是成比例變化的（如圖3）。這個恒定特性是指我們能夠根據綠色熒光探測器中的曲線面積（綠色熒光信號）

9、來精確推算出橙色熒光探測器 的曲線面積（如：橙色熒光信號）。 這兩個值的比值可在沒有FITC以外熒光的情況下計算得知。用于此目的的樣本被稱為“熒光補償調節樣本”或是熒光補 償質控物，用于精確測定補償值。對于典型的流式細胞儀來說，FITC發射光在橙色探測器中的信號大概是綠色探測器的15%。因此，如果我們從橙色探測器中 減秒綠色探測器信號的15%，那無論有多少FITC信號存在，經校準后的橙色熒光探測器信號將總為零。這時可在系統中加入PE熒光，橙色熒光探測器經扣除 了15%的綠色信號后將顯示真正的PE熒光信號，而不用再考慮是否存在FTIC熒光了。這就是“一步法”熒光補償：在第二探測器中修正

10、來自另一熒光的信 號。 二步法（雙）熒光補償從圖3的熒光譜中可見PE熒光也有部分滲漏至FITC探測器中。通過檢測只染有PE熒光的細胞來獲知此比例，一般它的數值是2%左右。這稱之為PE熒光補償校正物。 但如果PE熒光出現在FITC探測器中，而同時我們又使用FITC熒光來修正PE探測器中的熒光信號，那這還能有可 能來正確修正熒光滲漏來得真正的熒光信號嗎？一個不完整的答案來解釋此問題：在現有n色熒光分析實驗，n是指在儀器上同時檢測不確定的熒光數量；這個系統 的熒光補償功能可以完全解決此問題。實際上，根據一些數學運算是有可能使用這種方法來精確調節補償的（讀者可以跳過下一章節，而不必

11、研究其中原理）。xFn定義為在n探測器中檢測到的來自x熒光的信號。這樣fF1就是指FITC探測器中綠色熒光的信號；pF2是指橙色熒光探測器是PE熒光的信號。Dn是指探測n所檢測到的熒光信號。在此情況下，假設沒有任可背景熒光信號；背景熒光信號將稍后討論。于是：  在流式細胞儀分析中用到的“熒光補償”這個術語是指修正熒光滲漏的過程,如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。熒光補償過程從原理上來說相對簡單，但實際上涉及許多精細、敏感的方面從而使在實踐操作相當復雜。        非常不幸，熒光補償操作可能是在流式操作

12、中的數據采集和分析等步驟中最少被了解和掌握的內容，可能是因為在介紹它時經常要用到線性代數來計算，并且還要求 了解它的產生原理。然而，正確的熒光補償對于許多流式分析來說絕對是至關重要的，特別是對現常見的多抗原熒光表達強度分析。因為熒光補償常被誤解、誤用并 被許多不正確的觀念所包圍，許多實驗室的熒光補償設置都不正確。本章的一個部分將剖析有關補償的一些疑惑問題。         流式細胞儀的熒光補償隔一段時間之后需要調整到適合的位置。如果熒光補償沒有調節好，會導致細胞分群不明顯或者流式檢測得到的結果圖非常不漂亮，而且會影

13、 響到檢測結果的不真實。熒光補償的調節對初學者來說非常不容易掌握，同時，補償調節是流式細胞術中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見的標志檢測時，需要 經驗非常豐富的流式操作者根據多年的經驗判斷調節補償，才可以得到比較好的數據和圖片。那么，現在不需要這么麻煩。因為補償微球讓一切變得更簡單。BD CompBeads是專用于流式細胞儀多色分析的熒光補償調整微球。它的實用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時補償難調、耗費樣本（往往用 待測樣本單標來進行補償調節）的缺點。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結合來調節補償。它不但能象待測的樣本細胞一樣在同樣 的實驗條件下固定

14、、破膜等，操作起來很簡單，靈敏度高，一致性好，使補償更輕松更準確，而且最難得的是它最適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復合 熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因為這時的補償往往難度較大。各型號的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存， 方便下次做同樣的熒光染色搭配時參考用。       正確的熒光補償在將弱陽性群體與陰性群體正確區分中有極其重要的作用；熒光補償不足會導致弱陽性群體是假陽性顆粒增多，而過度補償則會丟失弱陽性群體而導致假陰性。     

15、;  熒光補償是指修正熒光光學信號在探測器之間相互滲漏并被數字化檢測的過程。       自單激光雙色分析出現后此過程變得十分重要。每種熒光素分子都具有自身的光譜發射范圍。這些發射光譜之間存在相互疊加，在某些情況下此現象十分明顯。在一 個雙探測器系統中，可設計將FITC熒光從PE熒光中分離出來。檢測熒光發射光時根據其波長和分布將選擇其中一小部分進入探測器，這部分熒光可由不同的濾 光片從全部發射光中選擇特定波長范圍的熒光來獲得。這樣，FTIC熒由530nm的濾光片選擇后送入探測器中；PE熒光則是由575nm濾光片來選擇。但 是

16、有部分FITC熒光會出現在PE探測器中，這是因為它的發射光涵蓋兩個探測器濾片的過濾范圍。這部分信號我們稱之為熒光滲漏，因為它是由FITC熒光滲 漏到PE探測器中的。注意想要設計一組熒光濾片來只收集FITC或PE信號是不可能的；因為當同事使用這兩種熒光染料時 熒光疊加總是存在的。這樣只要FITC熒光存在，就會在530nm區得到一個信號，同時也會在575nm區得另一些信號。如這時有PE熒光存在，它也將在 575nm區收集。那我們如何才能計數多少信號是來自PE而又有多少信號是由FITC引起的呢？這個計算過程我們稱為“熒光補償”，如去除FITC在PE 發射光譜帶上的熒光來修正PE探測器中的信號。一步法

17、熒光補償       如果一種熒光染料的 發射光可以被兩個含有不同波段的濾光片的探測器檢測到（如，在發射光譜的不同區域檢測），那么就能根據其中一個探測器的信號計算出另一個探測中有多少信 號。這是因為這兩個信號是成比例變化的。這個恒定特性是指我們能夠根據綠色熒光探測器中的曲線面積（綠色熒光信號）來精確推算出橙色熒光探測器的曲線面積 （如：橙色熒光信號）。         這兩個值的比值可在沒有FITC以外熒光的情況下計算得知。用于此目的的樣本被稱為“熒光補償

18、調節樣本”或是熒光補償質控物，用于精確測定補償值。對于典型的流式細胞儀來 說，FITC發射光在橙色探測器中的信號大概是綠色探測器的15%。因此，如果我們從橙色探測器中減秒綠色探測器信號的15%，那無論有多少FITC信號 存在，經校準后的橙色熒光探測器信號將總為零。這時可在系統中加入PE熒光，橙色熒光探測器經扣除了15%的綠色信號后將顯示真正的PE熒光信號，而不用 再考慮是否存在FTIC熒光了。這就是“一步法”熒光補償：在第二探測器中修正來自另一熒光的信號。 二步法（雙）熒光補償       通過檢測只染有PE熒光的細胞來獲知

19、此比例，一般它的數值是2%左右。這稱之為PE熒光補償校正物。         但 如果PE熒光出現在FITC探測器中，而同時我們又使用FITC熒光來修正PE探測器中的熒光信號，那這還能有可能來正確修正熒光滲漏來得真正的熒光信號 嗎？一個不完整的答案來解釋此問題：在現有n色熒光分析實驗，n是指在儀器上同時檢測不確定的熒光數量；這個系統的熒光補償功能可以完全解決此問題。圖2 ( 左側) 一個補償調節不正確的數據仍能被分析。這些圖譜數據是外周血經CD3FITC和CD4PE或PE同型對照染色檢測的結果。頂端的圖顯

20、示的是未經補償調節的數據；列圖中顯示了FITC到PE中的 補償依次增加后的結果。十字虛線是依據未染色樣本（或是經兩種熒光的同型對照染色）設定的來定義陽性細胞群體。實線門是依據單熒光-同型對照染色設定的。 注意在任何一張圖中，不用考慮補償是否正確，都可正確計算CD3陽性細胞中表達CD4（CD3+CD4+）細胞的數據，但必須是基于單熒光-同型對照染色 對照上的（左側）。完全以同型對照來設定的虛線十字門來統計將會導致錯誤的結果。僅在補償調節正確的情況下（中間圖）才能夠在CD3+CD4+細胞中準確 計算CD4熒光；補償不足時CD4熒光過強而當補償過度時出現了陰性群體。所以抗原濃度的檢測對不恰當的補償設定將會特別敏感。圖3 FITC和PE熒光發射光光譜。發射光（由熒光分受激發后發出的光線）