1、12補：原核細胞的基因結構補：原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區編碼區編碼區編碼區上游編碼區上游 編碼區下游編碼區下游 與與RNARNA聚酶結合位點聚酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子 RNA RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。并與其結合。 轉錄開始后，轉錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動，并分子移動，并以以DNADNA分子的一條鏈為模板合成分子的一條鏈為模板合成RNARNA。 轉錄完畢后，轉錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來，緊接著鏈釋放出來，緊接著RNARNA聚聚合酶也從合酶也從DNADNA模板鏈

2、上脫落下來。模板鏈上脫落下來。3不能轉錄為信使不能轉錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質。編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使：能轉錄相應的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質編碼蛋白質 編碼區編碼區非編碼區非編碼區原核原核細胞細胞的的 基因基因結構結構有調控遺傳信息表達的核有調控遺傳信息表達的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區上最重要的是位于編碼區上 游的游的RNARNA聚合酶結合位點。聚合酶結合位點。啟動子啟動子4補：真核細胞的基因結構補：真核細胞的基因結構編碼區編碼區非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區與與RNARNA聚酶聚酶結合位點結合位點內含子內含子

3、 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質的序列叫做內不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子，內含子能轉錄為信使含子，內含子能轉錄為信使RNA RNA 啟動子啟動子終止子終止子編碼區上游編碼區上游 編碼區下游編碼區下游 內含子：內含子： 外顯子：外顯子： 5真核真核細胞細胞的的 基因基因結構結構編碼區編碼區非編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，：有調控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區上游的包括位于編碼區上游的RNARNA 聚合酶結合位點

4、。聚合酶結合位點。非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區和內含子包括非編碼區和內含子6原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區是編碼區是_的的編碼區是間隔的、編碼區是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質的都由能夠編碼蛋白質的_和具和具有調控作用的有調控作用的_區組成的區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞與真核細胞的基因結構比較思思考考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續連續不連續不連續編碼區編碼區非編碼非編碼7基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟1 1、

5、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構建、基因表達載體的構建3 3、將目的基因導入受體細胞、將目的基因導入受體細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定89一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_編碼蛋白質的結構基因編碼蛋白質的結構基因請舉出三個以上的例子請舉出三個以上的例子2 2、獲取目的基因的方法、獲取目的基因的方法（1 1）從基因文庫中獲取）從基因文庫中獲取（2 2）利用）利用PCRPCR技術擴增技術擴增（3 3）人工合成）人工合成第二教材第二教材P P8 8預習導航預習導航10基因文庫的構建方法基因文庫的構建方法1 1

6、）鳥槍法：）鳥槍法：供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運載體運載體限制酶限制酶載入載入受體細胞受體細胞產生特定性狀產生特定性狀導入導入外源外源DNADNA擴增擴增目的基因目的基因分離分離受體細胞受體細胞( (直接分離法直接分離法) )112 2）反轉錄法：）反轉錄法： 以目的基因轉錄成以目的基因轉錄成的信使的信使RNARNA為模板，反為模板，反轉錄成互補的單鏈轉錄成互補的單鏈DNADNA，然后在酶的作用下合成然后在酶的作用下合成雙鏈雙鏈DNADNA，從而獲得所，從而獲得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADN

7、A( (即目的基因即目的基因) )反轉錄反轉錄合成合成基因文庫的構建方法基因文庫的構建方法123 3）根據已知的氨基酸序列合成）根據已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根據已知蛋白質的根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相氨基酸序列，推測出相應的信使應的信使RNARNA序列，然序列，然后按照堿基互補配對原后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列蛋白質的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列結構基因的

8、核苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學合成化學合成基因文庫的構建方法基因文庫的構建方法13上述三種目的基因提取的方法有何優缺點？上述三種目的基因提取的方法有何優缺點？優點優點缺點缺點鳥槍法鳥槍法反轉錄法反轉錄法根據已知氨基根據已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作簡便操作簡便廣泛使用廣泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分離出來的有時并分離出來的有時并非一個基因非一個基因專一性強專一性強操作過程麻煩，操作過程麻煩，mRNAmRNA很不穩定，要很不穩定，要求的技術條件較高求的技術條件較高專一性最強專一性最強僅限于合成核苷酸僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因對較少的簡單基因14(2)(2

9、)利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件：_、 _、_ (_ (做啟動子做啟動子) )、 _._.前提條件：前提條件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增為擴增循循 環的次數）環的次數）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數指數2 2n n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍

10、地擴增使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增15過程：過程：a a、DNADNA變性變性（90-9690-96）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火、退火（復性復性25-6525-65）：系統溫度降低，引）：系統溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端端延伸，合成與模板互補延伸，合成與模板互補 的的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈165 5/ /3 3/

11、 /GGGGTCTC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /AGAG引物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物PCRPCR原理原理變性變性復性復性延伸延伸175 5/ /3 3/ /GGGGTCTC5 5/ /3 3/ /GGGGTCTC5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物3 3/ / 183 3/ /5 5/ /GAGACCCC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引

12、物引物5 5/ /3 3/ /GGGG引物引物3 3/ /5 5/ /3 3/ /GAGA引物引物19（3 3）人工合成：若基因）人工合成：若基因_，核苷酸序列又，核苷酸序列又 _ _ ，則可用此法。，則可用此法。較小較小已知已知20用一定的用一定的_切割切割 質粒，使其出現一個切質粒，使其出現一個切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因，使其產生的基因，使其產生_ _ _。2 2、基因表達載體的構建、基因表達載體的構建 核心核心將切下的目的基因片段插入質粒的將切下的目的基因片段插入質粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質粒）

13、分子（重組質粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同21質粒質粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）經此過程，基因表達載體的構建就成功了？經此過程，基因表達載體的構建就成功了？2 2、基因表達載體的構建、基因表達載體的構建 核心核心同一種同一種22基因表達載體的組成：基因表達載體的組成：目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標記基因標記基因2

14、33 3、將目的基因導入受體細胞、將目的基因導入受體細胞轉化轉化 方法方法將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態細胞感受態細胞目的基因進入目的基因進入_內，并且在內，并且在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩定穩定表達表達24通過目的基因上的標記基因，進行篩選和檢測通過目的基因上的標記基因，進行篩選和檢測 導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入

15、重組重組DNADNA分子嗎？分子嗎？真正能攝入重組真正能攝入重組DNADNA分子的受體細胞很少。分子的受體細胞很少。 所以要對受體細胞作怎樣的處理？所以要對受體細胞作怎樣的處理？對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測 怎樣進行檢測？怎樣進行檢測？254 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測檢測鑒定鑒定檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗

16、蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗原抗體雜交26DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNADNA分分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 271）以下說法正

17、確的是）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列酸序列 B、質粒是基因工程中唯一的運載體、質粒是基因工程中唯一的運載體 C、運載體必須具備的條件之一是：具有多、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現出來、基因控制的性狀都能在后代表現出來C C282）不屬于質粒被選為基因運載體的理由是）不屬于質粒被選為基因運載體的理由是 A、能復制、能復制 （ ） B、有多個限制酶切點、有多個限制酶切點 C、具有標記基因、具有標記基因 D、它是環狀、它是環狀DNA293）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內切酶用于目的基因的獲得限制性內切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內切酶人工合成目的基因不用限制性內切酶304）有關基因工程的敘述正確的是）有關基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質