1、第八章第八章 蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定l一、測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的意義一、測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量的意義l二、常量凱氏定氮法二、常量凱氏定氮法l三、微量凱氏定氮法三、微量凱氏定氮法l四、自動(dòng)凱氏定氮儀四、自動(dòng)凱氏定氮儀l五、氨基酸的分析五、氨基酸的分析一、概述一、概述l（一）測(cè)定意義l1、蛋白質(zhì)作為三大供能物質(zhì)，是食品的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。l2、人體組織的構(gòu)成成分。l3、構(gòu)成體內(nèi)各種重要物質(zhì)l4、蛋白質(zhì)不是越多越好（增加腎負(fù)擔(dān)，骨質(zhì)疏松）l5、不同食品中蛋白質(zhì)的含量不同，可作為質(zhì)量檢驗(yàn)的一種重要手段。（二）各種食物中蛋白質(zhì)的含量（二）各種食物中蛋白質(zhì)的含量l在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，在各種

2、不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般說(shuō)來(lái)動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性一般說(shuō)來(lái)動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品食品l例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉中左右，豬肉中為為9.5%，兔肉為，兔肉為21%，雞肉為，雞肉為20%，牛乳為，牛乳為3.5%黃魚(yú)為黃魚(yú)為17.0%，帶魚(yú)為，帶魚(yú)為18.0%，大豆為，大豆為40%，稻米，稻米 為為8.5%，面粉為，面粉為9.9%，菠菜為，菠菜為2.4%，黃瓜為，黃瓜為1.0%，桃為，桃為0.8%，柑橘為，柑橘為0.9%，蘋(píng)果為蘋(píng)果為0.4%和油菜為和油菜為1.5%左右。左右。新型蛋白質(zhì)類(lèi)食品l單細(xì)胞蛋白：螺旋藻l螺旋藻植物

3、蛋白質(zhì)含量最高達(dá)70%，相當(dāng)于牛肉的3倍，包含全部八種人體所需又無(wú)法自身合成的氨基酸，是人類(lèi)最為最理想的蛋白質(zhì)天然寶庫(kù)。（三）測(cè)定原理（三）測(cè)定原理l凱氏定氮法l通過(guò)測(cè)定食品中n的含量，再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，就可以得到蛋白質(zhì)的含量 = n6.25 = 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量l而一般來(lái)說(shuō)，食品中蛋白質(zhì)的含氮量為16，所以，測(cè)得的含氮量再乘以6.25，就能得到蛋白質(zhì)的含量。16%n二、凱氏定氮法（國(guó)標(biāo)法）二、凱氏定氮法（國(guó)標(biāo)法）l1、原理l樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再

4、以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。化學(xué)反應(yīng)方程式化學(xué)反應(yīng)方程式2、儀器、儀器 3 3、試劑 硫酸硫酸(密度為密度為1.8419 g/l) ； 硫酸銅硫酸銅(cuso4.5h2o)； 硫酸鉀；硫酸鉀；k2so4 40%氫氧化鈉；氫氧化鈉； 混合指示劑：混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液與甲基紅乙醇溶液與0.1%甲基藍(lán)乙醇甲基藍(lán)乙醇溶 液 ， 臨 用 時(shí) 按溶 液 ， 臨 用 時(shí) 按 2 : 1 的 比 例 混 合 。的 比 例 混 合 。 或者或者0.1%甲基紅乙醇溶液與甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液，溴甲酚綠乙醇溶液，臨用時(shí)按臨用時(shí)按1:5的比例混合；的

5、比例混合； 2%硼酸溶液：硼酸溶液： 0 .1moll鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃濃h2so4l在消化階段起決定性作用在消化階段起決定性作用l具有脫水性：使有機(jī)物脫水后被炭化為具有脫水性：使有機(jī)物脫水后被炭化為c、h、nl具有氧化性：將有機(jī)物徹底氧化具有氧化性：將有機(jī)物徹底氧化lc+2h2so4 co2+2h2o+2so2l3so2+2n+3h2o 2nh3+3so3l2nh3+h2so4 （nh3 ）2so4 (cuso4.5h2o)l在消化階段作催化劑，在蒸餾反應(yīng)時(shí)作指在消化階段作催化劑，在蒸餾反應(yīng)時(shí)作指示劑。示劑。lc+2cuso4cu2so4+ so2+ co2lcu2so4+ h2so

6、4 2cuso4 +2 h2o + so2l有機(jī)物被全部消化后，溶液呈清澈的藍(lán)綠有機(jī)物被全部消化后，溶液呈清澈的藍(lán)綠色。色。k2so4l在消化時(shí)提高溶液的沸點(diǎn)在消化時(shí)提高溶液的沸點(diǎn)lk2so4 +h2so42khso4l330 400 400 l2khso4 k2so4 + so2 +h2o l在消化過(guò)程中，隨著在消化過(guò)程中，隨著h2so4的不斷分解，水分不的不斷分解，水分不斷蒸發(fā)，斷蒸發(fā)， k2so4的濃度逐漸增大，加速了對(duì)有機(jī)的濃度逐漸增大，加速了對(duì)有機(jī)物的分解作用。物的分解作用。lk2so4與與h2so4的用量比不宜過(guò)大，否則會(huì)損失氨。的用量比不宜過(guò)大，否則會(huì)損失氨。4、操作步驟、操作步

7、驟l樣品消化 蒸餾、吸收 滴定（1）消化）消化l準(zhǔn)確稱(chēng)取固體樣品準(zhǔn)確稱(chēng)取固體樣品0.22.0g，液體，液體1020ml，置，置于于500ml凱氏燒瓶中。凱氏燒瓶中。l加入硫酸銅加入硫酸銅0.2g，硫酸鉀，硫酸鉀6g，濃硫酸，濃硫酸20ml，搖勻。，搖勻。l置于電爐上，成置于電爐上，成45度角，度角，小火加熱。小火加熱。l待泡沫停止后，加大火力，待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液體變藍(lán)綠保持微沸，至液體變藍(lán)綠色透明，再繼續(xù)加熱色透明，再繼續(xù)加熱0.51h，取下冷卻后，小心加，取下冷卻后，小心加入入20ml水，轉(zhuǎn)移至水，轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶，定容。容量瓶，定容。（2）蒸餾、吸收）蒸餾、吸收

8、l按左圖連接好裝置，塞緊按左圖連接好裝置，塞緊瓶口，冷凝管下端插入吸瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶下（瓶中有收瓶下（瓶中有50ml4硼酸和混合指示劑）。放硼酸和混合指示劑）。放松夾子，加入松夾子，加入7080ml氫氧化鈉溶液，至瓶中溶氫氧化鈉溶液，至瓶中溶液變?yōu)樯钏{(lán)色或產(chǎn)生黑色液變?yōu)樯钏{(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀，再加入沉淀，再加入100ml蒸餾蒸餾水，夾緊夾子，加熱蒸餾，水，夾緊夾子，加熱蒸餾，至氨全部蒸出（至氨全部蒸出（250ml）。）。（3）滴定）滴定l將上述吸收液用將上述吸收液用0.1000mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定至藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色即為終點(diǎn)，記錄鹽酸用量。至藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色即為

9、終點(diǎn)，記錄鹽酸用量。l計(jì)算公式計(jì)算公式100014. 0mfcvw（4）注意事項(xiàng)）注意事項(xiàng)l消化時(shí)間一般約消化時(shí)間一般約4小時(shí)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。但若小時(shí)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。但若賴(lài)氨酸或組氨酸含量較多時(shí)需要延長(zhǎng)時(shí)間。賴(lài)氨酸或組氨酸含量較多時(shí)需要延長(zhǎng)時(shí)間。l樣品中脂肪或糖較多時(shí)消化時(shí)間要長(zhǎng)些，還應(yīng)注意發(fā)樣品中脂肪或糖較多時(shí)消化時(shí)間要長(zhǎng)些，還應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫，為防止其溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)要生的大量泡沫，為防止其溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)要小火加熱，并不時(shí)搖動(dòng)，必要時(shí)甚至可以停止加熱半小火加熱，并不時(shí)搖動(dòng)，必要時(shí)甚至可以停止加熱半小時(shí)。小時(shí)。l蒸餾裝置不能漏氣，在蒸餾過(guò)程中要注意接頭處有無(wú)蒸餾

10、裝置不能漏氣，在蒸餾過(guò)程中要注意接頭處有無(wú)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢后先將吸收瓶脫離冷凝管，繼續(xù)松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢后先將吸收瓶脫離冷凝管，繼續(xù)蒸餾蒸餾1分鐘，將附著在尖端的標(biāo)準(zhǔn)酸液完全洗入吸收分鐘，將附著在尖端的標(biāo)準(zhǔn)酸液完全洗入吸收瓶，再取下來(lái)，最后滅火。瓶，再取下來(lái)，最后滅火。l混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，中性溶液中呈灰色，混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈紅色。酸性溶液中呈紅色。三、微量凱氏定氮法三、微量凱氏定氮法l原理與常量凱氏定氮法相同l試劑除0 .01moll鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液外其余也同鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液外其余也同常量凱氏定氮法，只是加試劑量減少了。l設(shè)備區(qū)別也不大l操作同常

11、量凱氏定氮法設(shè)備安裝設(shè)備安裝步驟步驟 采樣（固體采樣、液體采樣） 樣品預(yù)處理 樣品分析 樣品數(shù)據(jù)處理 撰寫(xiě)分析報(bào)告四、自動(dòng)凱氏定氮儀四、自動(dòng)凱氏定氮儀l稱(chēng)取樣品（通常為一克）加入試劑，消解催化劑；l在預(yù)定溫度下將樣品（6-40個(gè)隨消化爐的不同而不同）同時(shí)消化（一般條件為420度，30-45分鐘）；l經(jīng)冷卻和稀釋?zhuān)恢芎徒邮芷糠胖玫絻x器上。l按下start鍵，起動(dòng)堿泵加堿，蒸汽泵加蒸汽，硼酸泵向接受瓶中加硼酸。l選擇蒸餾時(shí)間四五分鐘，自動(dòng)完成蒸餾；l滴定，計(jì)算氮及蛋白含量。五、氨基酸的分析五、氨基酸的分析l甲醛滴定法l發(fā)酵工業(yè) 中用得較多，用于測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中氨基酸的含量變化。1、甲醛滴定法

12、的原理、甲醛滴定法的原理 l氨基酸分子中含有堿性氨基和酸性羧基，在水溶液中以雙性離子（內(nèi)鹽）存在，因此不能直接用酸滴定氨基，也不能用堿滴定羧基。將氨基酸（水溶液）用中性甲醛水溶液處理，常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基化合物，促使一nh3+釋放h+，使溶液的酸度增加，堿性消失，溶液顯示出羧基的酸性，可以用酚酞作指示劑，直接用標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定，以間接方法求出樣液中氨基酸的含量，終點(diǎn)ph為8.5-9.5。2、試劑和器材、試劑和器材l（1） 01 moll標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液 l（2）酚酞指示劑）酚酞指示劑 l 0.1酚酞的酚酞的50乙醇溶液乙醇溶液（3）中性甲醛溶液）中性甲醛

13、溶液 l 在在50ml 3637分析純甲醛溶液中加入分析純甲醛溶液中加入1 ml 01酚酞乙醇水溶液，用酚酞乙醇水溶液，用01 moll的氫氧化鈉的氫氧化鈉溶液滴定到微紅，貯于密閉的玻璃瓶中。此試劑在臨溶液滴定到微紅，貯于密閉的玻璃瓶中。此試劑在臨用前配制。如已放置一段時(shí)間，則使用前需重新中和。用前配制。如已放置一段時(shí)間，則使用前需重新中和。（4）錐形瓶）錐形瓶 微量滴定管微量滴定管 吸管吸管 磁力攪拌器磁力攪拌器 phs -3型數(shù)字顯示酸度計(jì)型數(shù)字顯示酸度計(jì)3、操作過(guò)程、操作過(guò)程l準(zhǔn)確吸取樣液準(zhǔn)確吸取樣液5.0ml 于于100ml容量瓶中，加水至刻度。容量瓶中，加水至刻度。搖勻后準(zhǔn)確移取搖勻后準(zhǔn)確移取20.0ml于于250ml燒杯中，加燒杯中，加60ml水，水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定至滴定至ph為為8.2，記，記錄消耗的錄消耗的naoh毫升數(shù)，可計(jì)算總酸度。毫升數(shù)，可計(jì)算總酸度。l加加10.0ml甲醛于燒杯中，混勻，再用標(biāo)準(zhǔn)甲醛于燒杯中，混勻，再用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定滴定至至ph為為9.2，記錄消耗的，記錄消耗的naoh毫升數(shù)。毫升數(shù)。l同時(shí)取同時(shí)取80ml蒸餾水先用標(biāo)準(zhǔn)蒸餾水先用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定至滴定至ph為為8.2