1、0.05%環孢素滴眼液穩定性的長期試驗考察1. 前言 環孢素（Cyclosporine，CS）是一種真菌源性、由11個氨基酸組成的親脂性環狀多肽類物質，也是一種高效免疫抑制劑。它廣泛地應用于器官移植和多種自身免疫性疾病的治療中1，也是國際上認可的可以治療干眼癥的處方藥2。其藥理作用主要通過選擇性、可逆性地抑制T淋巴細胞而實現，通過轉導作用，作用于T細胞活化過程中信號，抑制神經鈣蛋白，進而抑制T細胞增長與分化3，最終達到免疫抑制效果。在臨床上多用于治療器官移植后的免疫排斥反應、類風濕性關節炎4等自身免疫疾病，并且可提高存活率。環孢素用于眼表疾病也具有顯著的療效。其在眼科的應用分為全身用藥和局部用

2、藥兩種方式。然而全身用藥受到血-眼屏障等因素不易進入眼內，并且會帶來嚴重的不良反應5，因此多為眼局部用藥。角膜移植排斥反應是由供體角膜的特殊抗原引起的一種炎性反應。環孢素作為一種強效免疫抑制劑，可有效抑制角膜移植后的免疫排斥反應6，在臨床的治療方面仍以糖皮質激素和環孢素為主，但是長時間應用激素會產生多種不良反應。環孢素抑制T細胞由G0期向G1期轉變，從而抑制T淋巴細胞的抗原呈遞并抑制白介素2和-干擾素的產生，減輕術后的排斥反應7。 蠶蝕性角膜潰瘍又名Moorens潰瘍，是一種慢性、進行性、疼痛性角膜潰瘍，初發于角膜周邊部位，沿角膜周邊部延伸，并向角膜中央匍行發展，最終累及全角膜。術后常規應用激

3、素和環孢素滴眼液及環磷酰胺等免疫抑制劑藥物治療。該術后藥物維持治療研究結果8證明局部環孢素滴眼液單獨或聯合板層角膜移植術可以有效治療難治性蠶蝕性角膜潰瘍。腺病毒感染引起的流行性角膜結膜炎（Epidemic keratitis conjunctivitis，EKC）是一種世界性廣泛流行的眼部傳染病，但可通過自身免疫系統的建立，很快自愈。其臨床特點是急性濾泡性或假膜性結膜炎，伴有角膜上皮下浸潤，常由免疫反應所引起。通常需要歷時一定時間才會吸收，長達數月、甚至數年潰瘍不會形成9，如果瞳孔區發生了病變，定會對該病人的視力造成的傷害較為嚴重。Jeng10等報道應用環孢素聯合糖皮質激素點眼對其進行治療較為

4、理想，應用環孢素進行治療會顯得更加有效、安全、無副作用。此外，環孢素多用于治療臨床中常見的干眼癥(DES)11，干眼癥多為種復雜原因所致淚液質和量及動力學的異常從而導致淚膜不穩定性和或眼表面異常、并伴有眼部不適癥狀的一類疾病。在臨床方面用藥效果較好，可以有效緩解干眼等不適癥狀，且不良反應小，可以長期使用。干眼癥又名角結膜干燥癥(KCS) ，是因為眼表淚液減少、黏液分泌異常等原因引發的淚液蒸發較多，分布異常的綜合征。其大致可分為四種類型：由于淚腺功能低下所致的水樣夜缺乏性干眼?。挥捎谏逞?、化學傷所致的黏性蛋白缺乏性干眼?。挥捎谘鄄€缺損、配帶角膜接觸鏡等導致淚液分布不均勻而引起淚液動力學異常；由于

5、瞼板腺功能障礙引起脂質缺乏性干眼癥；在普通人群中的發病率為0.3%12，干眼癥的治療應著手于去除病因，減少眼表和淚腺的炎癥，改善淚膜的結構和功能。 DES的發病率與多種因素有關，其中50歲以上女性患病率約為男性的2倍。 在某些疾病中，其發病率更高，如在糖尿病患者和風濕性關節炎患者中分別為54.3%和46.7%13。環孢素滴眼液療效好，且無全身性不良反應，近年來在歐美國家臨床得到了廣泛應用。對于斯耶格倫氏綜合征(Sjorgrens syndrome)這類與炎癥相關的干眼癥，可使用環孢素等消炎藥進行治療14。各類臨床試驗也證明，使用環孢素滴眼液能增加患者眼淚量。環孢素較人造眼淚的療效要好，某些患者

6、經人造眼淚治療數月無效，但使用環孢素后效果顯著，且增強了患者角膜及結膜知覺的敏感度15。患有家族性淀粉樣多發性神經病變的患者，通過環孢素治療后干眼癥狀明顯減輕，且無任何不良反應16。環孢素的作用是有效緩解慢性干眼癥潛在的炎癥過程，局部應用環孢素能阻止某些患者干眼進程，對治療干眼癥有良好的療效。 滴眼劑是眼病治療常用途徑。環孢素具有脂溶性，易溶于植物油中，現如今環孢素的眼用劑型為普通乳劑型滴眼劑。由于環孢素的相對分子質量大且呈疏水性，眼內通透性差，難以達到治療水平，影響療效。 微乳（microemulsion, ME）系指粒徑為10100nm的乳滴分散在另一種液體介質形成的熱力學穩定的膠體溶液。

7、微乳一般在一定條件下可自發（或輕度振搖）形成，其乳滴多為大小比較均勻的球形，呈透明或半透明狀。微乳是由油相、表面活性劑（SF）、助表面活性劑（CoSF）以及水相組成的，在一定溫度長時間放置或離心(1300 r/min，30min)均較穩定。 我們按照中國藥典關于溶液顏色檢查法的方法、澄清度檢查法以及制劑穩定性指導原則的要求對該制劑的穩定性進行長期試驗考察。按藥物制劑穩定性重點考察項目，考察滴眼液性狀、可見異物、含量、PH值、有關物質及無菌情況。為0.05%環孢素滴眼液的生產、包裝、貯存、使用條件提供科學依據。 102 儀器與試藥2.1 儀器數顯無極恒速攪拌器 （鞏義市英峪予華儀器廠）日本島津產

8、LC-10AVP型高效液相色譜儀SPD-10AVP型紫外檢測器LC-10AVP泵CTO-10AVP柱溫箱Class-up工作站Shim-packvp-ODS色譜柱（150mm*4.6mm）日本島津產紫外分光光度計UV-2450 隔膜真空泵GM-0.33 (天津市津騰實驗設備有限公司）電子分析天平AG135 (梅特勒-托利多儀器有限公司）實驗室pH計FE20 (梅特勒-托利多儀器有限公司） Model C3860A超聲儀 (CBL Photoelectron Technology CoLid)滲透壓摩爾濃度測定儀SMC 30B (天河醫療儀器有限公司）針頭式微孔濾膜過濾器 (天津市雙 吉色譜儀器

9、經營部）一次性使用無菌注射器 (浙江京環醫療用品有限公司）燈檢裝置A帶有遮光板的日光燈光源B不反光的黑色背景；C不反光的白色背景和底部D反光的白色背景（指遮光板內側）。藥品光照試驗箱 溫度 XMTA908 光照強度XMTA808 （重慶漢瞻儀器有限公司） 調溫調濕箱 （天津天宇機電有限公司） 2.2 試藥 環孢素 (福建科瑞藥業有限公司，批號：140201（N）)環孢素對照品 （中國藥品生物制品鑒定所，含量為98.8%）大豆油 (新興（鐵嶺）藥業有限公司，批號：15050106-2-01)聚乙二醇PEG400 （江西益普生藥業有限公司，批號：20141001）聚山梨酯80 （四川金山制藥有限公

10、司，批號：150502）羥苯乙酯 （廣州市廣譜醫藥有限公司，批號：141102）甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）乙腈 （特級品，天津市康科德科技有限公司）磷酸 （化學純，石家莊市試劑廠冀都化學試劑有限公司）水為純化水三乙胺為分析純0.05%環孢素滴眼液 （自制三批：160203,160204,160205）色譜用試劑為色譜純，其他試劑為分析純，水為注射用水。3 方法3.1 樣品的制備： 取羥苯乙酯0.3g加入700ml純化水，加熱使之溶解，加入60ml聚乙二醇-400，攪拌，混勻；取0.5g環孢素至乳缽中，加10 ml大豆油，80 ml聚山梨酯80，充分研磨，倒入上述溶液中，快速攪拌

11、，加純化水至1000ml，混勻，0.45m微孔濾膜過濾，無菌分裝，即得。3.2 色譜條件及方法學研究：3.2.1色譜條件： 色譜柱： Shim-packvp-ODS色譜柱（150mm*4.6mm）流動相： 乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.5），用磷酸調pH到2.93檢驗波長： 210nm柱溫： 65 C流速： 1.2 ml/min進流量： 飽和進樣 進樣量： 20L3.2.2樣品預處理：取C18固相萃取小柱兩個，串聯使用并將其活化（活化順序為：甲醇-水-水-甲醇，每次各5ml），用5ml的移液管精密吸取樣品5ml至小燒杯中，用注射器全部吸取并緩慢打入小柱，收集濾液，用注射器

12、二次吸取完全，再次通過小柱，棄去濾液，后用5ml純化水沖洗雜質，再用乙腈、水的混合液（1：1）洗脫樣品于10ml的容量瓶中定容，混勻。過濾（孔徑0.45m），作為供試品。3.2.3系統適應性實驗：用移液管精密量取該樣品5ml，按照3.2.2的處理方法操作，再3.2.1的色譜條件下進樣，記錄色譜圖，計算理論塔板數, 分離度。比較標準品、樣品和空白微乳的色譜圖。3.2.4標準曲線的繪制：精密稱取環孢素對照品25mg于50ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度使成儲備液。再分別精密移取儲備液3，4，5，6，7ml于10ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配成0.15,0.2,0.25,0.3,0.35g/

13、ml的溶液，并按上述色譜條件分別進樣，記錄對應的峰面積。以峰面積（Y）與對照品濃度（X）回歸，觀察其是否呈良好的線性關系，計算其回歸方程。3.3 制劑穩定性的長期試驗考察：3.3.1溶液的性狀： 本品為淡黃色澄明液體。照中國藥典溶液顏色檢查法，配制黃綠色調標準比色液。分別取62條件下，于0月，1月，2月，3月的環孢素滴眼液樣品直接與標準比色液比較，樣品與標準色體積相等，同置白色背景前，平視觀察。3.3.2鑒別在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間與對照品主峰的保留時間分別一致。3.3.3無菌情況的檢測： 取本品0.05%環孢素滴眼液，采用薄膜過濾法處理，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖

14、洗（每膜不少于100ml）,以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依照法檢查（中國藥典），應符合規定。3.3.4pH和滲透壓的檢查： 本品pH值應在5.06.5之間，滲透壓摩爾濃度應在290430mOsmol/kg范圍內。分別取62條件下0月，1月，2月，3月的0.05%環孢素滴眼液樣品適量，測定其pH值、滲透壓并觀察制劑理化性質是否穩定。3.3.5可見異物檢查：分別取62條件下0月，1月，2月，3月的環孢素滴眼液樣品20支，去除容器標簽，把容器外壁清潔干凈，調節光照度至20003000lx，將供試品置于遮光板邊緣處，并在人眼的清晰觀測距離內（約為25cm），分別置于黑色和白色背景下，手持供試品頸部輕

15、輕旋轉和翻轉容器使藥液中可能存在的可見異物懸?。ǖ珣苊猱a生氣泡），輕輕翻搖后即用目檢視，重復3次，總時限為20秒。樣品制劑在靜置一定時間后輕輕旋轉時應無煙霧、狀微粒柱，且沒有檢出金屬屑、玻璃屑、長度或最大粒徑超過2mm的纖維和塊狀物等明顯可見異物；也沒有檢查出微細可見異物（如點狀物、2mm以下的短纖維和塊狀物等）。根據檢測結果，觀察該0.05%環孢素滴眼液樣品的可見異物檢查是否符合標準。3.3.6樣品含量的測定：取0.05%環孢素滴眼液樣品，按照3.2.2樣品預處理方法項下操作，供試品20l進樣，使用外標法根據峰面積計算樣品的含量。要求該制劑含環孢素（C62H111N11O12）的含量應在9

16、0%110%的范圍內。3.3.7有關物質檢測：分別取62條件下0月，1月，2月，3月的0.05%環孢素滴眼液樣品適量，進行精密稱定。按照3.2.2的操作步驟完成樣品預處理后，然后用乙腈定容，制成每1ml中含0.25mg的溶液，作為供試品溶液；同理制成每1ml中約有2.5g的溶液，作為對照液。照含量測定項下的色譜條件，取對照液20l注入液相色譜儀，調節靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20l，分別進樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，供試品溶液色譜圖中，單個雜質峰面積不得大于對照液主峰面積的7/10 (0.7%)，測得的各個雜質峰面積之和不得大于

17、對照液主峰面積的1.5倍（1.5%），按照處方制備的要求制作出不含環孢素的空白微乳，做為對照空白；供試品溶液中和空白對照重合的峰應被扣除。4 結果與分析4.1 系統適應性試驗結果：經證明，在此實驗條件下能達到環孢素與制劑中其他組分的的分離，按環孢素主峰的保留時間及峰寬計算出理論塔板數n=2328.30600，分離度R=3.0181.5,均符合藥典要求。如圖4-1、4-2、4-3圖4-1 環孢素色譜圖圖4-2 空白色譜圖圖4-3 標準品色譜圖4.2 標準曲線繪制：如圖4-4 圖4-4標準曲線圖以峰面積（Y）與對照品濃度（X）回歸,在0.15-0.35g范圍內，呈良好的線性關系?；貧w方程為Y=21

18、07x+201893.5(r2=0.9996)。4.3穩定性考察結果：取3批環孢素滴眼液，置于62環境中放置，分別于第0，1，2，3月取樣檢測，考察性狀、可見異物、無菌情況、pH、滲透壓、及藥物含量等指標。結果表明，3批樣品在62環境中放置，分別于第0，1，2，3月取樣檢測，各指標均符合規定，如表4-6穩定性考察結果：表4-6穩定性考察結果4.4 樣品含量測定 表4-6中數據顯示，三批樣品的標示量百分含量分別均在90.0%110.0%的范圍之內，該制劑含量符合相關規定。4.5 有關物質的檢查： 在62條件下0月，1月，2月，3月自制0.05%環孢素滴眼液的有關物質測定結果：如表4-6。經過長期

19、的試驗觀察，測得的單個雜質峰面積均小于對照液主峰面積的7/10，各雜質峰面積的和均小于對照液主峰面積的1.5倍，符合規定。表4-7 有關物質測定結果 綜上試驗結果表明：0.05%環孢素滴眼液在62的儲存條件下，經過0月，1月，2月，3月的穩定性考察其性狀，pH值、滲透壓、有關物質、含量等理化性質均合格，符合中國藥典標準。5 討論5.1 微乳型制劑確定： 眼部生理結構復雜，具有高度的敏感性和獨特的保護屏障，因此眼部給藥存在較大的差異，眼部藥物傳遞系統的設計存在很大的困難。微乳乳滴由油相、SF、CoSF和水相組成，適合作為水中溶解度較小的藥物的載體，其界面膜具有兩親性，有利于藥物穿過角膜屏障進入眼

20、內，提高藥物在眼部的生物利用度。環孢素眼用制劑在臨床上通常使用0.05%的濃度，且低濃度環孢素對眼部的刺激很小，患者的耐受性較佳。微乳是一種安全、穩定、刺激性小的新型給藥系統，且兼具制備方便、易于滅菌、生產成本低等優勢，正在被科研工作者投以越來越多的關注。微乳與傳統的滴眼液相比具有顯著的優點。傳統眼用制劑目前在市場上應用雖然廣泛，但是這些傳統劑型的主要缺點是眼部的生物利用度很低。在眼球運動和鼻淚系統的作用下會導致藥物在角膜前停留時間變短,藥物的跨角膜轉運也會因藥物自身的理化性質和角膜的屏障作用而受到影響。一般情況下只有小于5%的藥物才可以進入眼睛的前房組織?；颊呤褂玫窝垡阂貜投啻谓o藥,對于術

21、后的患者應用更為不便。因此，研究新型眼部藥物載體來促進眼部的吸收、提高眼部的生物利用度是相當重要的。本制劑0.05%環孢素滴眼液用油性基質制成微乳型滴眼液，具有安全、緩釋、穩定、刺激性低的優點。5.2 樣品的預處理原因：本試驗的樣品為水包油型微乳，加之大量輔料，不能直接進樣，必須通過破乳或者固相萃取小柱，使藥物暴露出來才能進行檢測。本實驗曾試過用乙腈破乳，破乳效果良好，但由于輔料聚山梨酯80與藥物溶解性相似，不易分離，且聚山梨酯80的含量遠遠大于藥物環孢素，聚山梨酯80對藥物的檢測有很大的影響。后使用固相萃取小柱，水洗時可將大部分的輔料和聚山梨酯80洗去，大大降低了聚山梨酯80的干擾。為了防止

22、萃取小柱本身對樣品的吸附，減少檢測過程中所造成的干擾，需對萃取小柱進行活化，即用5ml甲醇和5ml純化水分別通過萃取小柱，并吹干。通過活化過的C18固相萃取小柱，先用水將大部分輔料和聚山梨酯80洗去，再用乙腈將藥物洗脫出來進樣，這樣可以減少雜質造成的干擾。5.3 流動相的配比： 本實驗曾試過的流動相有乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：1.0）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（180：620：200：1.0）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（220：580：200：1.0）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：620：180：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：580：220：0.5）；乙腈：甲

23、醇：水：三乙胺（220：600：180：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（180：600：120：0.5）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.25）；乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：1.0）；等等。多組流動相的配比，最終考慮基線，保留時間，峰形等各個方面的因素，選擇 乙腈：甲醇：水：三乙胺（200：600：200：0.5），用磷酸調流動相的pH到2-3之間。5.4 柱溫的確定本實驗的柱溫定為65 ，有充分的理論與實踐意義。若柱溫過高，會使儀器的穩定性降低，產生基線的漂移；若柱溫過低，則會嚴重影響到峰形以及出峰時間。由于環孢素相對分子質量大，脂溶性高，采用色譜柱

24、分離時需用較高的柱溫才能使其有效分離，否則峰形很寬，呈丘陵狀。本實驗分別嘗試使用了55，60，65，70，75 的柱溫，發現隨著柱溫升高，峰寬逐步減小，峰形改善明顯，考慮到柱溫太高會影響色譜柱壽命，故最終確定柱溫為65 。因此，經試驗證實，65 為本實驗的最佳柱溫。5.5 流速的選擇流速主要決定出峰的時間，該實驗過程中進行了三個流速的測定，分別為1.0 ml/min、1.2 ml/min、1.5 ml/min。在流速低的情況下，會出現出峰時間拖后的現象；若是流速較高的話，分離度則會受到影響。出峰時間最好控制在10-20 min之間，綜合考慮，最終決定使用流速為1.2 ml/min。5.6 藥物

25、制劑穩定性的意義藥物制劑穩定性是指藥物制劑從制備到使用期間質量發生變化的速度和程度，是評價藥物制劑質量的重要指標之一。藥物制劑的穩定性通過進行實驗來觀察藥物的理化性質，對藥品在制備過程中及保存期間可能發生的物理化學變化進行相關考察，探討其影響因素，尋找避免或延緩藥物降解、增加藥物制劑穩定性各種措施，預測制劑在貯存期間質量標準的最長時間。藥物制劑穩定性研究的意義在于保證藥品的質量，作到安全、有效、穩定。還可以用于指導新藥及其劑型的研制和開發，在某種定程度上也可以減少經濟損失。因此，藥物制劑的穩定性研究對于保證產品質量以及安全療效方面具有重要意義。對藥物制劑穩定性的研究是為了提高藥品的內在質量，應

26、全面地考慮各種因素對藥物制劑穩定性所產生的影響，從而篩選出最佳處方為臨床提供安全，穩定，有效的藥物制劑。5.7 pH的穩定性觀察正常淚液的pH值在7.27.4之間（患眼病時有所改變）。滴眼液的pH過低會因刺激而大量分泌淚液，從而稀釋藥液并將藥物沖出結膜囊，影響藥物作用效果。同時，過于偏酸的藥液可凝固眼黏膜，造成損害；pH值過高可使眼黏膜上皮細胞硬化或膨脹，導致組織壞死。所以在配置滴眼液時，常加入緩沖物質以調節溶液pH值，使其與淚液大體相近，減少刺激性。正常人眼可耐受的pH值范圍為5.09.0之間。通過對0.05%環孢素滴眼液pH值的穩定性觀察，發現其pH值均在5.06.5范圍內，在實驗觀察過程中無明顯變化，符合眼用制劑的要求。5.8 滲透壓穩定性觀察 在涉及溶質的擴散或通過生物膜生物膜的液體轉運各種生物過程中，滲透壓都起著極其重要的作用。因此，在制備眼用液體制劑等藥物制劑時，需要觀察其滲透壓的穩定性。溶液的滲透壓，依賴于溶液中溶質粒子的數量，是溶液的依數性之一通常以滲透壓摩爾濃度來表示。本實驗使用SMC 30B滲透壓摩爾濃度測定儀對0